本文關(guān)鍵詞： 沙眼衣原體 DNA疫苗 基因 MOMP 密碼子 佐劑　出處：《山東大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)泌尿生殖道感染是一種常見(jiàn)的性傳播疾病(STD)，近年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。女性生殖道Ct感染可引起宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等嚴(yán)重后遺癥從而造成不孕和異位妊娠，同時(shí)Ct的感染還能提高HIV傳播的機(jī)率。雖然抗生素對(duì)沙眼衣原體早期泌尿生殖道感染有很好療效，但由于無(wú)癥狀性衣原體感染普遍存在，給預(yù)防Ct的感染和并發(fā)癥帶來(lái)很大困難。因而有效地控制沙眼衣原體性傳播疾病需依賴安全有效的疫苗的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。 沙眼衣原體是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物，具有獨(dú)特的生活周期，有兩種形態(tài)和代謝差別很大的生活形式：其感染形式是原體(elementarybody，EB)，繁殖形式是始體(reticulate body，RB)。EB的外膜成分是衣原體致病性的決定因素，也是宿主免疫系統(tǒng)的主要靶分子。其中衣原體主要外膜蛋白(majorouter membrane protein，MOMP)能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，是Ct疫苗研究的主要靶抗原。但迄今為止，MOMP疫苗尚存在許多缺陷：免疫原性弱，，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體水平低，只能提供部分保護(hù)性免疫。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者進(jìn)行了優(yōu)化密碼的研究，即用哺乳動(dòng)物基因組偏愛(ài)密碼取代低表達(dá)的病原生物基因的相應(yīng)密碼，密碼改建后基因編碼的氨基酸不變，蛋白表達(dá)水平顯著提高。此類研究在某些病毒疫苗的研究中已取得較大進(jìn)展，在某些原核生物中也有顯著效果，但有關(guān)衣原體優(yōu)化密碼基因疫苗的研究目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。 在本課題組以往的研究中，我們以鼠型沙眼衣原體(C. muridarum，以往稱為MoPn)為研究對(duì)象，自行設(shè)計(jì)合成了優(yōu)化密碼的主要外膜蛋白基因(HuMOMP，GeneBank accession NO．AY732495)，構(gòu)建了MOMP基因真核表達(dá)質(zhì)粒，證實(shí)了優(yōu)化密碼能夠增強(qiáng)MOMP蛋白在體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。本研究在以上工作基礎(chǔ)上，通過(guò)小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了優(yōu)化密碼沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的免疫作用。首先我們成功地培養(yǎng)，擴(kuò)增及純化了鼠型沙眼衣原體，建立了小鼠生殖道感染模型，為評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)性效果奠定了基礎(chǔ)。然后采用肌內(nèi)免疫方式免疫小鼠，比較了野生型及優(yōu)化型MOMP DNA疫苗的免疫效果及對(duì)衣原體生殖道感染攻擊的保護(hù)性。我們進(jìn)一步對(duì)優(yōu)化密碼DNA疫苗的免疫途徑及佐劑的添加等免疫條件進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)：采取滴鼻途徑粘膜免疫，添加霍亂毒素B亞單位和CpG佐劑。研究結(jié)果顯示此方案獲得了較好的免疫效果及抵抗衣原體感染的保護(hù)作用。本研究為探索高效衣原體基因疫苗提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于新型衣原體DNA疫苗的研究具有重要意義。 一、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)與純化及小鼠生殖道感染模型的建立 (一)、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增與純化 我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)室成功建立了鼠型沙眼衣原體體外培養(yǎng)與純化的方法，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。 人宮頸癌Hela229細(xì)胞用DEAE-葡聚糖處理后，感染一定劑量的鼠型沙眼衣原體，培養(yǎng)42-48小時(shí)衣原體即在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，完成其生活周期，擴(kuò)增產(chǎn)生大量具感染性的原體。收集衣原體感染的Hela229細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞及衣原體包涵體壁，釋放衣原體原體顆粒，經(jīng)低溫超速離心、泛影鈉-泛影葡胺密度梯度離心分離純化得到衣原體。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們對(duì)鼠型沙眼衣原體在hela229細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增及此后的純化的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了摸索。結(jié)果可在每175cm~2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增純化得到10~8IFU純度較高的鼠型沙眼衣原體，從而為此后的實(shí)驗(yàn)工作打下基礎(chǔ)。 (二)、鼠型沙眼衣原體生殖道感染小鼠模型的建立 建立在動(dòng)物模型基礎(chǔ)上的疫苗免疫效果的評(píng)定是疫苗研究進(jìn)程中必不可缺的一步。鼠型沙眼衣原體是沙眼衣原體的鼠生物變種，以小鼠為天然宿主，有利于研究病原體與宿主間的相互作用。利用鼠型沙眼衣原體建立的小鼠生殖道感染模型在國(guó)內(nèi)外均有應(yīng)用。但根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道，使用的衣原體滴度有很大差別。所以有必要在本實(shí)驗(yàn)室建立Ct小鼠生殖道感染模型，以便更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。 本研究通過(guò)陰道內(nèi)接種感染鼠型沙眼衣原體，建立Ct生殖道感染小鼠模型。通過(guò)采用不同數(shù)量的衣原體包涵體形成單位(IFU)感染小鼠，探討建立生殖道感染模型的合適感染劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用10~5IFU經(jīng)陰道感染6-8周齡雌性BALB／c小鼠即可造成輸卵管阻塞和輸卵管積水等并發(fā)癥。在感染后不同時(shí)間，生殖道組織出現(xiàn)不同的病理改變，主要的病理改變包括：感染早期，生殖道粘膜層水腫，粘膜層上皮細(xì)胞灶性壞死，糜爛；粘膜及粘膜下層中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。后期以明顯纖維組織增生，單核細(xì)胞浸潤(rùn)粘膜及粘膜下層為主要表現(xiàn)。小鼠Ct生殖道感染模型的建立為評(píng)價(jià)Ct DNA疫苗的免疫保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。 二、肌內(nèi)免疫裸DNA疫苗比較優(yōu)化密碼和野生型MOMP DNA疫苗的免疫效果 通過(guò)優(yōu)化密碼促進(jìn)外源蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性是提高DNA疫苗免疫效果的有效途徑之一。這在某些病毒DNA疫苗的相關(guān)研究中已取得可喜進(jìn)展(如HIV、HPV等)。通過(guò)優(yōu)化密碼提高某些細(xì)菌DNA疫苗(破傷風(fēng)桿菌、李斯特胞內(nèi)菌等)的免疫效果也已得到實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)。但目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到衣原體優(yōu)化密碼基因疫苗的研究報(bào)道。在本課題組以往的工作中，我們首次分析比較了鼠型沙眼衣原體和人、小鼠(大鼠)等基因組偏愛(ài)密碼子的使用差異。根據(jù)人類基因密碼子使用偏好對(duì)沙眼衣原體基因進(jìn)行了優(yōu)化，自行設(shè)計(jì)合成了優(yōu)化密碼鼠型沙眼衣原體MOMP基因。并成功構(gòu)建了HuMOMP和野生型MOMP(WtMOMP)DNA疫苗。本研究在以上工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，研究?jī)?yōu)化密碼是否提高沙眼衣原體DNA疫苗的免疫效果；并對(duì)優(yōu)化密碼影響沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。 (一)、肌內(nèi)免疫優(yōu)化密碼沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的研究 采用肌肉接種免疫的方式探討優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫作用。BALB／c小鼠分為四組：pcDNA3-HuMOMP免疫組、pcDNA3-WtMOMP免疫組、空載質(zhì)粒陰性對(duì)照組和滅活衣原體原體陽(yáng)性對(duì)照組。 通過(guò)血清和生殖道局部抗體檢測(cè)、細(xì)胞因子檢測(cè)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，以及生殖道衣原體攻擊試驗(yàn)來(lái)研究肌內(nèi)免疫優(yōu)化密碼DNA疫苗的免疫效應(yīng)。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、HuMOMP基因免疫組小鼠的DTH平均值以及脾淋巴細(xì)胞增殖SI值均明顯高于WtMOMP基因免疫組(P＜0.05)；說(shuō)明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能增強(qiáng)免疫小鼠的特異性細(xì)胞免疫。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HuMOMP基因免疫組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中特異性IFN-γ水平顯著高于WtMOMP基因免疫組(P＜0.05)，說(shuō)明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能明顯增強(qiáng)Th1類細(xì)胞免疫反應(yīng)。 2、小鼠血清特異性IgG抗體檢測(cè)結(jié)果表明，與WtMOMP基因免疫組相比，HuMOMP基因免疫組IgG水平有所提高，體液免疫有一定程度的增強(qiáng)。但小鼠生殖道SIgA檢測(cè)在各組小鼠中均顯示為陰性結(jié)果。提示，經(jīng)肌內(nèi)途徑接種MOMP DNA疫苗未能誘導(dǎo)生殖道粘膜產(chǎn)生特異性SIgA。 3、生殖道衣原體攻擊試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載質(zhì)粒對(duì)照組相比，HuMOMP基因免疫組小鼠對(duì)衣原體生殖道的攻擊產(chǎn)生了部分保護(hù)作用，表現(xiàn)為生殖道衣原體定植減少，生殖道感染病理改變較輕。HuMOMP基因免疫組的保護(hù)作用強(qiáng)于野生型MOMP基因免疫組，但兩者之間無(wú)顯著差異。 以上結(jié)果說(shuō)明，優(yōu)化密碼能夠增強(qiáng)沙眼衣原體MOMP DNA疫苗所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)水平，其中以Th1類細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)為主；肌內(nèi)途徑免疫優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗對(duì)衣原體生殖道的攻擊具有部分保護(hù)作用。 (二)、優(yōu)化密碼增強(qiáng)沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫原性的機(jī)制初探 以上研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化密碼能夠增強(qiáng)沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的免疫效應(yīng)，但其機(jī)制如何尚不清楚。 為探討優(yōu)化密碼DNA疫苗免疫效應(yīng)的增強(qiáng)是否與抗原蛋白的表達(dá)有直接的關(guān)系，我們比較了優(yōu)化密碼與野生型MOMP基因在小鼠肌肉內(nèi)的表達(dá)水平。提取各免疫組小鼠肌肉組織總蛋白，作Western blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：優(yōu)化密碼基因組可見(jiàn)明顯MOMP蛋白條帶(約40KD)，而野生型基因組在相應(yīng)分子量位置沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的蛋白條帶，說(shuō)明優(yōu)化密碼增強(qiáng)了MOMP蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平。HuMOMP DNA疫苗免疫效果的增強(qiáng)與密碼修飾增加了MOMP蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平有直接關(guān)系。 我們進(jìn)一步探討了優(yōu)化密碼增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中衣原體蛋白表達(dá)的機(jī)制。采用熒光定量RT-PCR方法分析了HuMOMP基因和野生型MOMP基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。 HuMOMP和WtMOMP基因轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，優(yōu)化密碼MOMP基因的mRNA水平僅為野生型MOMP基因的1.36倍(而我們以往的研究結(jié)果證明優(yōu)化密碼MOMP基因的蛋白表達(dá)可增強(qiáng)至少10倍以上)。說(shuō)明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，此兩種MOMP基因在mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。這與大多數(shù)學(xué)者在優(yōu)化密碼相關(guān)研究(HPV6b E7，BPV L1等)中獲得的結(jié)論相一致，即在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，野生型基因與人源化基因在mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但在蛋白表達(dá)水平兩者差異明顯。提示，人源化優(yōu)化密碼基因蛋白表達(dá)增加的機(jī)制可能主要在轉(zhuǎn)錄后水平。具體哪些因素在轉(zhuǎn)錄后水平影響了MOMP蛋白的表達(dá)，我們將在以后的工作中進(jìn)行深入研究。 三、粘膜免疫優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫效果和霍亂毒素B亞單位及CpG基因佐劑的增效作用 Ct感染后，細(xì)胞免疫和體液免疫共同參與針對(duì)Ct的特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答，CD4~+Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)在清除Ct感染中起重要作用�？笴t MOMP SIgA的存在，減少了陰道感染率和相關(guān)的炎癥反應(yīng)，在防御Ct感染中具有明顯作用。因此安全有效的Ct疫苗應(yīng)引起Th1類反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的保護(hù)性細(xì)胞免疫和強(qiáng)的粘膜SIgA反應(yīng)。 我們前一部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙眼衣原體MOMP DNA疫苗通過(guò)肌內(nèi)途徑免疫小鼠主要誘導(dǎo)Th1占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞免疫反應(yīng)但不能誘導(dǎo)產(chǎn)生生殖道粘膜局部特異性SIgA，免疫保護(hù)作用不理想。因此，在本部分工作中我們進(jìn)一步探討了MOMP DNA疫苗的粘膜免疫作用，試圖找到既能誘導(dǎo)Th1占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，又能產(chǎn)生生殖道粘膜局部SIgA抗體反應(yīng)的免疫方式，以期獲得更好的保護(hù)性免疫。 霍亂毒素是迄今最有效的粘膜免疫佐劑之一，能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)傾向于Th2型。CpG基因佐劑是比較新的一種能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞免疫的粘膜免疫佐劑，并且具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)類型的作用。聯(lián)合應(yīng)用霍亂毒素和CpG做為蛋白疫苗粘膜佐劑在國(guó)外研究中已有成功報(bào)道，獲得了較好的協(xié)同作用。但此兩種佐劑聯(lián)合應(yīng)用，能否增強(qiáng)DNA疫苗的粘膜免疫效應(yīng)尚不清楚。在本研究中我們采用無(wú)毒性但保留了粘膜佐劑作用的霍亂毒素B亞單位(CTB)和CpG共同做為佐劑，通過(guò)滴鼻的方式研究?jī)?yōu)化密碼MOMPDNA疫苗的粘膜免疫效果。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組為：以CTB和CpG為佐劑的HuMOMP DNA疫苗組和空載質(zhì)粒組，單獨(dú)HuMOMP DNA疫苗免疫組，以及PBS空白對(duì)照組和接種活Ct原體的陽(yáng)性對(duì)照組。免疫方式：鼻腔粘膜免疫。通過(guò)血清和生殖道局部抗體檢測(cè)、細(xì)胞因子檢測(cè)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，以及生殖道衣原體攻擊試驗(yàn)來(lái)研究?jī)?yōu)化密碼DNA疫苗的免疫效應(yīng)和保護(hù)性作用。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、CTB和CpG為佐劑的HuMOMP DNA疫苗免疫組小鼠(1)Ct特異性細(xì)胞免疫明顯增強(qiáng)，其中以Th1類細(xì)胞免疫占主要優(yōu)勢(shì)(IFN-γ明顯升高(2037.03pg／ml)，為PBS組的136.5倍，為單獨(dú)HuMOMP免疫組的3倍；IgG2a明顯升高(OD值為0.98)，與Ct-EB陽(yáng)性對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(1.30，P＞0.05)。(2)生殖道Ct特異性SIgA抗體升高(OD值為0.732)；與Ct-EB陽(yáng)性對(duì)照組接近(0.88，P＞0.05)。(3)對(duì)Ct生殖道的攻擊具有較強(qiáng)免疫保護(hù)作用，甚至與Ct-EB陽(yáng)性對(duì)照組的保護(hù)作用水平相當(dāng)。表現(xiàn)為Ct生殖道的定植明顯減少、清除加快；感染后第12天僅有生殖道局部少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，未造成上行感染，輸卵管、卵巢基本正常。 2、單獨(dú)優(yōu)化密碼HuMOMP DNA疫苗鼻腔接種只能誘導(dǎo)低水平的細(xì)胞免疫及體液免疫，對(duì)Ct生殖道的攻擊的保護(hù)作用較低，感染后第12天陰道、子宮粘膜下有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)，輸卵管壁增厚，有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。 以上結(jié)果說(shuō)明，CTB和CpG佐劑能夠顯著增強(qiáng)優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗粘膜免疫的免疫效果：免疫小鼠產(chǎn)生以Th1類占主要優(yōu)勢(shì)的特異性細(xì)胞免疫及生殖道局部SIgA抗體反應(yīng)；并能誘導(dǎo)與Ct-EB免疫小鼠相當(dāng)?shù)拿庖弑Ｗo(hù)作用，有效抵抗衣原體的生殖道攻擊。 綜上所述，本研究分別自肌內(nèi)及滴鼻免疫途徑系統(tǒng)探討了優(yōu)化密碼MOMPDNA疫苗的免疫效應(yīng)，為新型沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的研究及有效粘膜免疫佐劑的選擇提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以上研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭燕,趙蔚明,周亞濱,王紅,欒怡,于修平;HPV6b野生型E7基因與優(yōu)化密碼E7基因mRNA表達(dá)的分析[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年04期

2 陳木開(kāi),韓建德,陳小紅,涂裕英;MoPn沙眼衣原體致小鼠生殖道感染模型的初步研究[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2004年08期

本文編號(hào)：1450836