發(fā)布時間：2018-01-21 07:20

  本文關(guān)鍵詞： 沙眼衣原體 DNA疫苗 基因 MOMP 密碼子 佐劑　出處：《山東大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)泌尿生殖道感染是一種常見的性傳播疾病(STD)，近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢。女性生殖道Ct感染可引起宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等嚴重后遺癥從而造成不孕和異位妊娠，同時Ct的感染還能提高HIV傳播的機率。雖然抗生素對沙眼衣原體早期泌尿生殖道感染有很好療效，但由于無癥狀性衣原體感染普遍存在，給預防Ct的感染和并發(fā)癥帶來很大困難。因而有效地控制沙眼衣原體性傳播疾病需依賴安全有效的疫苗的開發(fā)與應用。 沙眼衣原體是一類專性細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物，具有獨特的生活周期，有兩種形態(tài)和代謝差別很大的生活形式：其感染形式是原體(elementarybody，EB)，繁殖形式是始體(reticulate body，RB)。EB的外膜成分是衣原體致病性的決定因素，也是宿主免疫系統(tǒng)的主要靶分子。其中衣原體主要外膜蛋白(majorouter membrane protein，MOMP)能誘導宿主產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫，是Ct疫苗研究的主要靶抗原。但迄今為止，MOMP疫苗尚存在許多缺陷：免疫原性弱，，誘導宿主產(chǎn)生抗體水平低，只能提供部分保護性免疫。近年來，國外學者進行了優(yōu)化密碼的研究，即用哺乳動物基因組偏愛密碼取代低表達的病原生物基因的相應密碼，密碼改建后基因編碼的氨基酸不變，蛋白表達水平顯著提高。此類研究在某些病毒疫苗的研究中已取得較大進展，在某些原核生物中也有顯著效果，但有關(guān)衣原體優(yōu)化密碼基因疫苗的研究目前國內(nèi)外尚未見報道。 在本課題組以往的研究中，我們以鼠型沙眼衣原體(C. muridarum，以往稱為MoPn)為研究對象，自行設計合成了優(yōu)化密碼的主要外膜蛋白基因(HuMOMP，GeneBank accession NO．AY732495)，構(gòu)建了MOMP基因真核表達質(zhì)粒，證實了優(yōu)化密碼能夠增強MOMP蛋白在體外培養(yǎng)哺乳動物細胞中的表達。本研究在以上工作基礎上，通過小鼠動物實驗進一步探討了優(yōu)化密碼沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的免疫作用。首先我們成功地培養(yǎng)，擴增及純化了鼠型沙眼衣原體，建立了小鼠生殖道感染模型，為評價疫苗的保護性效果奠定了基礎。然后采用肌內(nèi)免疫方式免疫小鼠，比較了野生型及優(yōu)化型MOMP DNA疫苗的免疫效果及對衣原體生殖道感染攻擊的保護性。我們進一步對優(yōu)化密碼DNA疫苗的免疫途徑及佐劑的添加等免疫條件進行了重新設計：采取滴鼻途徑粘膜免疫，添加霍亂毒素B亞單位和CpG佐劑。研究結(jié)果顯示此方案獲得了較好的免疫效果及抵抗衣原體感染的保護作用。本研究為探索高效衣原體基因疫苗提供了新思路和實驗依據(jù)，對于新型衣原體DNA疫苗的研究具有重要意義。 一、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)與純化及小鼠生殖道感染模型的建立 (一)、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)、擴增與純化 我們在本實驗室成功建立了鼠型沙眼衣原體體外培養(yǎng)與純化的方法，為后續(xù)工作奠定了基礎。 人宮頸癌Hela229細胞用DEAE-葡聚糖處理后，感染一定劑量的鼠型沙眼衣原體，培養(yǎng)42-48小時衣原體即在細胞內(nèi)形成包涵體，完成其生活周期，擴增產(chǎn)生大量具感染性的原體。收集衣原體感染的Hela229細胞，超聲破碎細胞及衣原體包涵體壁，釋放衣原體原體顆粒，經(jīng)低溫超速離心、泛影鈉-泛影葡胺密度梯度離心分離純化得到衣原體。 在實驗過程中，我們對鼠型沙眼衣原體在hela229細胞內(nèi)擴增及此后的純化的最佳實驗條件進行了摸索。結(jié)果可在每175cm~2的細胞培養(yǎng)瓶中擴增純化得到10~8IFU純度較高的鼠型沙眼衣原體，從而為此后的實驗工作打下基礎。 (二)、鼠型沙眼衣原體生殖道感染小鼠模型的建立 建立在動物模型基礎上的疫苗免疫效果的評定是疫苗研究進程中必不可缺的一步。鼠型沙眼衣原體是沙眼衣原體的鼠生物變種，以小鼠為天然宿主，有利于研究病原體與宿主間的相互作用。利用鼠型沙眼衣原體建立的小鼠生殖道感染模型在國內(nèi)外均有應用。但根據(jù)不同的實驗室報道，使用的衣原體滴度有很大差別。所以有必要在本實驗室建立Ct小鼠生殖道感染模型，以便更準確地評價疫苗的免疫效果。 本研究通過陰道內(nèi)接種感染鼠型沙眼衣原體，建立Ct生殖道感染小鼠模型。通過采用不同數(shù)量的衣原體包涵體形成單位(IFU)感染小鼠，探討建立生殖道感染模型的合適感染劑量。實驗結(jié)果表明，使用10~5IFU經(jīng)陰道感染6-8周齡雌性BALB／c小鼠即可造成輸卵管阻塞和輸卵管積水等并發(fā)癥。在感染后不同時間，生殖道組織出現(xiàn)不同的病理改變，主要的病理改變包括：感染早期，生殖道粘膜層水腫，粘膜層上皮細胞灶性壞死，糜爛；粘膜及粘膜下層中性粒細胞浸潤。后期以明顯纖維組織增生，單核細胞浸潤粘膜及粘膜下層為主要表現(xiàn)。小鼠Ct生殖道感染模型的建立為評價Ct DNA疫苗的免疫保護作用奠定了基礎。 二、肌內(nèi)免疫裸DNA疫苗比較優(yōu)化密碼和野生型MOMP DNA疫苗的免疫效果 通過優(yōu)化密碼促進外源蛋白在宿主細胞中的表達，增強DNA疫苗的免疫原性是提高DNA疫苗免疫效果的有效途徑之一。這在某些病毒DNA疫苗的相關(guān)研究中已取得可喜進展(如HIV、HPV等)。通過優(yōu)化密碼提高某些細菌DNA疫苗(破傷風桿菌、李斯特胞內(nèi)菌等)的免疫效果也已得到實驗研究的證實。但目前，國內(nèi)外尚未見到衣原體優(yōu)化密碼基因疫苗的研究報道。在本課題組以往的工作中，我們首次分析比較了鼠型沙眼衣原體和人、小鼠(大鼠)等基因組偏愛密碼子的使用差異。根據(jù)人類基因密碼子使用偏好對沙眼衣原體基因進行了優(yōu)化，自行設計合成了優(yōu)化密碼鼠型沙眼衣原體MOMP基因。并成功構(gòu)建了HuMOMP和野生型MOMP(WtMOMP)DNA疫苗。本研究在以上工作基礎上，進一步進行動物免疫試驗，研究優(yōu)化密碼是否提高沙眼衣原體DNA疫苗的免疫效果；并對優(yōu)化密碼影響沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的機制進行了初步探索。 (一)、肌內(nèi)免疫優(yōu)化密碼沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的研究 采用肌肉接種免疫的方式探討優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫作用。BALB／c小鼠分為四組：pcDNA3-HuMOMP免疫組、pcDNA3-WtMOMP免疫組、空載質(zhì)粒陰性對照組和滅活衣原體原體陽性對照組。 通過血清和生殖道局部抗體檢測、細胞因子檢測、遲發(fā)型超敏反應、脾淋巴細胞增殖試驗，以及生殖道衣原體攻擊試驗來研究肌內(nèi)免疫優(yōu)化密碼DNA疫苗的免疫效應。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、HuMOMP基因免疫組小鼠的DTH平均值以及脾淋巴細胞增殖SI值均明顯高于WtMOMP基因免疫組(P＜0.05)；說明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能增強免疫小鼠的特異性細胞免疫。細胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HuMOMP基因免疫組脾細胞培養(yǎng)上清中特異性IFN-γ水平顯著高于WtMOMP基因免疫組(P＜0.05)，說明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能明顯增強Th1類細胞免疫反應。 2、小鼠血清特異性IgG抗體檢測結(jié)果表明，與WtMOMP基因免疫組相比，HuMOMP基因免疫組IgG水平有所提高，體液免疫有一定程度的增強。但小鼠生殖道SIgA檢測在各組小鼠中均顯示為陰性結(jié)果。提示，經(jīng)肌內(nèi)途徑接種MOMP DNA疫苗未能誘導生殖道粘膜產(chǎn)生特異性SIgA。 3、生殖道衣原體攻擊試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載質(zhì)粒對照組相比，HuMOMP基因免疫組小鼠對衣原體生殖道的攻擊產(chǎn)生了部分保護作用，表現(xiàn)為生殖道衣原體定植減少，生殖道感染病理改變較輕。HuMOMP基因免疫組的保護作用強于野生型MOMP基因免疫組，但兩者之間無顯著差異。 以上結(jié)果說明，優(yōu)化密碼能夠增強沙眼衣原體MOMP DNA疫苗所誘導的細胞免疫和體液免疫反應水平，其中以Th1類細胞免疫反應增強為主；肌內(nèi)途徑免疫優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗對衣原體生殖道的攻擊具有部分保護作用。 (二)、優(yōu)化密碼增強沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫原性的機制初探 以上研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化密碼能夠增強沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的免疫效應，但其機制如何尚不清楚。 為探討優(yōu)化密碼DNA疫苗免疫效應的增強是否與抗原蛋白的表達有直接的關(guān)系，我們比較了優(yōu)化密碼與野生型MOMP基因在小鼠肌肉內(nèi)的表達水平。提取各免疫組小鼠肌肉組織總蛋白，作Western blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：優(yōu)化密碼基因組可見明顯MOMP蛋白條帶(約40KD)，而野生型基因組在相應分子量位置沒有肉眼可見的蛋白條帶，說明優(yōu)化密碼增強了MOMP蛋白在小鼠體內(nèi)的表達水平。HuMOMP DNA疫苗免疫效果的增強與密碼修飾增加了MOMP蛋白在細胞中的表達水平有直接關(guān)系。 我們進一步探討了優(yōu)化密碼增強哺乳動物細胞中衣原體蛋白表達的機制。采用熒光定量RT-PCR方法分析了HuMOMP基因和野生型MOMP基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達。 HuMOMP和WtMOMP基因轉(zhuǎn)染COS-1細胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，優(yōu)化密碼MOMP基因的mRNA水平僅為野生型MOMP基因的1.36倍(而我們以往的研究結(jié)果證明優(yōu)化密碼MOMP基因的蛋白表達可增強至少10倍以上)。說明，在哺乳動物細胞內(nèi)，此兩種MOMP基因在mRNA的表達水平?jīng)]有明顯差異。這與大多數(shù)學者在優(yōu)化密碼相關(guān)研究(HPV6b E7，BPV L1等)中獲得的結(jié)論相一致，即在哺乳動物細胞中，野生型基因與人源化基因在mRNA表達水平無明顯差異，但在蛋白表達水平兩者差異明顯。提示，人源化優(yōu)化密碼基因蛋白表達增加的機制可能主要在轉(zhuǎn)錄后水平。具體哪些因素在轉(zhuǎn)錄后水平影響了MOMP蛋白的表達，我們將在以后的工作中進行深入研究。 三、粘膜免疫優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫效果和霍亂毒素B亞單位及CpG基因佐劑的增效作用 Ct感染后，細胞免疫和體液免疫共同參與針對Ct的特異性保護性免疫應答，CD4~+Th1細胞免疫反應在清除Ct感染中起重要作用�？笴t MOMP SIgA的存在，減少了陰道感染率和相關(guān)的炎癥反應，在防御Ct感染中具有明顯作用。因此安全有效的Ct疫苗應引起Th1類反應占優(yōu)勢的保護性細胞免疫和強的粘膜SIgA反應。 我們前一部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙眼衣原體MOMP DNA疫苗通過肌內(nèi)途徑免疫小鼠主要誘導Th1占優(yōu)勢的細胞免疫反應但不能誘導產(chǎn)生生殖道粘膜局部特異性SIgA，免疫保護作用不理想。因此，在本部分工作中我們進一步探討了MOMP DNA疫苗的粘膜免疫作用，試圖找到既能誘導Th1占優(yōu)勢的細胞免疫反應，又能產(chǎn)生生殖道粘膜局部SIgA抗體反應的免疫方式，以期獲得更好的保護性免疫。 霍亂毒素是迄今最有效的粘膜免疫佐劑之一，能誘導產(chǎn)生體液免疫，但其誘導產(chǎn)生的細胞免疫反應傾向于Th2型。CpG基因佐劑是比較新的一種能夠誘導產(chǎn)生Th1型細胞免疫的粘膜免疫佐劑，并且具有調(diào)節(jié)免疫反應類型的作用。聯(lián)合應用霍亂毒素和CpG做為蛋白疫苗粘膜佐劑在國外研究中已有成功報道，獲得了較好的協(xié)同作用。但此兩種佐劑聯(lián)合應用，能否增強DNA疫苗的粘膜免疫效應尚不清楚。在本研究中我們采用無毒性但保留了粘膜佐劑作用的霍亂毒素B亞單位(CTB)和CpG共同做為佐劑，通過滴鼻的方式研究優(yōu)化密碼MOMPDNA疫苗的粘膜免疫效果。 實驗動物分組為：以CTB和CpG為佐劑的HuMOMP DNA疫苗組和空載質(zhì)粒組，單獨HuMOMP DNA疫苗免疫組，以及PBS空白對照組和接種活Ct原體的陽性對照組。免疫方式：鼻腔粘膜免疫。通過血清和生殖道局部抗體檢測、細胞因子檢測、遲發(fā)型超敏反應、脾淋巴細胞增殖試驗，以及生殖道衣原體攻擊試驗來研究優(yōu)化密碼DNA疫苗的免疫效應和保護性作用。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、CTB和CpG為佐劑的HuMOMP DNA疫苗免疫組小鼠(1)Ct特異性細胞免疫明顯增強，其中以Th1類細胞免疫占主要優(yōu)勢(IFN-γ明顯升高(2037.03pg／ml)，為PBS組的136.5倍，為單獨HuMOMP免疫組的3倍；IgG2a明顯升高(OD值為0.98)，與Ct-EB陽性對照組相比無顯著差異(1.30，P＞0.05)。(2)生殖道Ct特異性SIgA抗體升高(OD值為0.732)；與Ct-EB陽性對照組接近(0.88，P＞0.05)。(3)對Ct生殖道的攻擊具有較強免疫保護作用，甚至與Ct-EB陽性對照組的保護作用水平相當。表現(xiàn)為Ct生殖道的定植明顯減少、清除加快；感染后第12天僅有生殖道局部少量炎細胞浸潤，未造成上行感染，輸卵管、卵巢基本正常。 2、單獨優(yōu)化密碼HuMOMP DNA疫苗鼻腔接種只能誘導低水平的細胞免疫及體液免疫，對Ct生殖道的攻擊的保護作用較低，感染后第12天陰道、子宮粘膜下有較多炎細胞浸潤，輸卵管壁增厚，有炎細胞浸潤。 以上結(jié)果說明，CTB和CpG佐劑能夠顯著增強優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗粘膜免疫的免疫效果：免疫小鼠產(chǎn)生以Th1類占主要優(yōu)勢的特異性細胞免疫及生殖道局部SIgA抗體反應；并能誘導與Ct-EB免疫小鼠相當?shù)拿庖弑Ｗo作用，有效抵抗衣原體的生殖道攻擊。 綜上所述，本研究分別自肌內(nèi)及滴鼻免疫途徑系統(tǒng)探討了優(yōu)化密碼MOMPDNA疫苗的免疫效應，為新型沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的研究及有效粘膜免疫佐劑的選擇提供了新思路和實驗依據(jù)。以上研究在國內(nèi)外尚未見報道。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄭燕,趙蔚明,周亞濱,王紅,欒怡,于修平;HPV6b野生型E7基因與優(yōu)化密碼E7基因mRNA表達的分析[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2003年04期

2 陳木開,韓建德,陳小紅,涂裕英;MoPn沙眼衣原體致小鼠生殖道感染模型的初步研究[J];中國人獸共患病雜志;2004年08期

本文編號：1450836