本文關(guān)鍵詞：HMGB1內(nèi)化的分子機(jī)制及其生物學(xué)功能研究　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種含量豐富的非組蛋白，同源性高，在幾乎所有的細(xì)胞類型中都有表達(dá)。HMGB1主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括兩個(gè)HMG box結(jié)構(gòu)(box A和boxB)和一個(gè)高度負(fù)電性的羧基末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CT)。最初發(fā)現(xiàn)其作為核因子直接參與基因表達(dá)調(diào)控，近年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其具有豐富的生物學(xué)功能，包括參與腦的發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、纖維蛋白溶酶原的活化、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞分化以及廣泛參與全身的炎癥反應(yīng)和組織損傷等。 膿毒癥仍然是目前臨床危重患者的重要死因之一，其死亡率高達(dá)30～70％。過去十幾年中臨床利用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)拮抗劑治療都未取得滿意效果，這是因?yàn)檫@些因子通常在發(fā)病早期釋放，至晚期病人病情持續(xù)加重甚至死亡時(shí)，其水平已恢復(fù)正常。研究表明，HMGB1作為重要的晚期炎癥介質(zhì)在全身炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。致炎刺激脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等激活的單核／巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)8～32h延遲后釋放HMGB1，同時(shí)壞死組織細(xì)胞崩解也釋放出大量的HMGB1。釋放到細(xì)胞外的HMGB1分子通過進(jìn)一步激活單核或內(nèi)皮等細(xì)胞，引起大量炎癥因子和黏附分子的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致并參與了包括腦組織、肺、胃腸道、關(guān)節(jié)、心臟等多種臟器的炎癥損傷以及廣泛的全身性炎癥反應(yīng)甚至死亡。由此可見，HMGB1在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的中樞作用。 HMGB1參與炎癥反應(yīng)的分子基礎(chǔ)及其相關(guān)信號(hào)過程一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，近年來也取得了一些進(jìn)展，但很多過程仍不明確，特別是HMGB1作用于細(xì)胞的信號(hào)機(jī)制。近年研究者們陸續(xù)鑒定出HMGB1的一些細(xì)胞表面受體，包括晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、toll樣受體(toll-like receptor，TLR)家族成員以及α趨化因子受體，但阻斷所有這些受體仍不能完全抑制HMGB1對(duì)細(xì)胞的作用，表明細(xì)胞表面可能還存在其它受體或其它可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。HMGB1可以攜帶DNA載體進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并有效表達(dá)，結(jié)合近年來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或它們的受體可以被細(xì)胞內(nèi)化(internalization)而參與后續(xù)信號(hào)反應(yīng)，我們推測(cè)HMGB1可能也可以被效應(yīng)細(xì)胞內(nèi)化，且其內(nèi)化活性與其豐富的生物學(xué)功能密切相關(guān)。 細(xì)胞和外界進(jìn)行著廣泛的物質(zhì)交換。除一些小分子物質(zhì)外，大多數(shù)生物大分子包括蛋白、多糖、多核苷酸以及一些病毒、細(xì)菌顆粒、壞死調(diào)亡細(xì)胞的產(chǎn)物都是通過內(nèi)化的方式進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)化廣泛參與人體各種生理和病理過程。內(nèi)吞(endocytosis)是大分子物質(zhì)內(nèi)化的最重要的方式，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，有多種信號(hào)通路參與，包含了廣泛的蛋白與蛋白以及蛋白與脂質(zhì)、糖類的相互作用。目前研究較清楚的特異性內(nèi)化方式是經(jīng)典的依賴包涵素的內(nèi)吞途徑(clathrin-dependent endocytosis)，即生物大分子在相應(yīng)受體介導(dǎo)下通過形成有包涵素(clathrin)包被的小泡而被內(nèi)吞，很多生物大分子包括低密脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素等都是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)行的。近年來研究較多的另一種重要的內(nèi)吞途徑是非經(jīng)典的不依賴包涵素的內(nèi)吞途徑，其中最重要的是胞膜窖(caveolae)介導(dǎo)的內(nèi)吞。胞膜窖是細(xì)胞膜上脂筏(lipid raft)的一種，是細(xì)胞膜上的一塊瓶頸形內(nèi)陷的膜結(jié)構(gòu)，富含膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂以及特征性蛋白—窖蛋白1(caveolin-1)。最初研究這個(gè)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，近年發(fā)現(xiàn)其參與了多種細(xì)菌和病毒顆粒，如霍亂毒素(cholera toxin，CTx)和猿病毒40(simian virus 40，SV40)等的內(nèi)化過程。硫酸肝素蛋白多糖(heparansulfate proteoglycan，HSPG)是廣泛存在于細(xì)胞表面和基底膜的一類糖蛋白，由硫酸肝素(heparan sulfate，HS)和核心蛋白共價(jià)連接而成，它們作為共受體調(diào)節(jié)許多配體的特異性受體的激活，在細(xì)胞的機(jī)械支持、粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖、分化和形態(tài)形成中起重要作用。除此之外，研究還表明HSPG在內(nèi)化過程中也具有重要作用，可能是一種普遍的內(nèi)化機(jī)制中的重要分子。 基于以上認(rèn)識(shí)，本研究首先將HMGB1與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合表達(dá)，通過熒光定位觀察方法檢測(cè)HMGB1是否具有內(nèi)化活性；接著利用一系列與內(nèi)化通路相關(guān)的抑制劑和熒光染料與帶有綠色熒光的HMGB1蛋白共同孵育細(xì)胞，通過熒光共定位方法闡明HMGB1通過何種內(nèi)化通路進(jìn)行內(nèi)化；之后在生物信息學(xué)基礎(chǔ)上通過構(gòu)建HMGB1上不同結(jié)構(gòu)域片斷與EGFP的融合表達(dá)載體，利用熒光顯微鏡研究介導(dǎo)HMGB1內(nèi)化的功能域；進(jìn)一步我們運(yùn)用類似方法對(duì)鑒定出的HMGB1上可以有效內(nèi)化的結(jié)構(gòu)域—細(xì)胞因子誘導(dǎo)片段1(cytokine-inducing fragment 1，CIF1)的內(nèi)化機(jī)制進(jìn)行了研究；最后，我們?cè)谡婧思?xì)胞中表達(dá)了HMGB1的EGFP融合蛋白，為后續(xù)進(jìn)一步的深入研究打下基礎(chǔ)。 通過以上研究，我們得到了如下結(jié)論。第一、HMGB1以時(shí)間和能量依賴性方式通過內(nèi)吞作用被哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化，內(nèi)吞過程在15 min時(shí)已經(jīng)開始，1 h左右達(dá)到平衡，內(nèi)吞的HMGB1顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；第二、HMGB1可能通過與細(xì)胞膜表面HSPG的HS鏈相互作用，并在其特異性受體協(xié)助下，通過依賴胞膜窖的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，之后內(nèi)吞小泡在細(xì)胞骨架協(xié)助下在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，融合蛋白最終進(jìn)入細(xì)胞溶酶體；第三、HMGB1的CIF1段可以有效內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，其內(nèi)化機(jī)制與全長(zhǎng)HMGB1基本一致，但其并不是該蛋白上唯一具有內(nèi)化功能的片段，HMGB1上可能存在多個(gè)介導(dǎo)內(nèi)化的功能域；第四、HMGB1可能通過內(nèi)化介導(dǎo)了其刺激細(xì)胞釋放炎癥因子的功能。 HMGB1參與了失控性全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程，并作為炎癥反應(yīng)后期重要的炎癥因子，對(duì)病情轉(zhuǎn)歸起著關(guān)鍵作用。盡管已認(rèn)識(shí)到HMGB1在膿毒癥中具有關(guān)鍵作用，而且已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，但其參與炎癥反應(yīng)作用機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)仍不清楚。本研究對(duì)HMGB1的內(nèi)化機(jī)制進(jìn)行了初步研究，且證實(shí)HMGB1可能通過內(nèi)化介導(dǎo)了其刺激細(xì)胞釋放炎癥因子的功能。這些研究結(jié)果不但加深了我們對(duì)HMGB1生物學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，而且還有可能從根本上影響和改變臨床上對(duì)膿毒癥和失控性全身炎癥的認(rèn)識(shí)和治療方案，因而具有極為重要的基礎(chǔ)理論和臨床治療意義。
[Abstract]:High mobility group box ( 1 ) , which is widely present in eukaryotic cells , has high homology and is expressed in almost all kinds of cell types . The high mobility group box ( 1 ) is mainly composed of three domains , including two HMG box structures ( box A and box B ) and a highly electronegative carboxyl terminal domain ( CT ) . It has been found that it is directly involved in gene expression regulation as a nuclear factor , and has been found to have abundant biological functions in recent years , including the development of the brain and the growth of nerve cells , the activation of plasminogen , the metastasis of tumor cells , the differentiation of immune cells and the wide participation in systemic inflammatory response and tissue damage . The clinical use of tumor necrosis factor ( TNF ) and interleukin - 1 ( IL - 1 ) antagonist therapy in the past decade has not achieved satisfactory results . In recent years , some cellular surface receptors , including advanced glycosylation end products ( RAGE ) , toll - like receptor ( TLR ) family members and 偽 chemokine receptors , have been identified by researchers in recent years . In recent years , many biological macromolecules , including proteins , polysaccharides , polynucleotides and some viruses , bacterial particles and necrotic apoptotic cells , have been endocytosis by internalization . Many biological macromolecules include low density lipoprotein ( LDL ) , transferrin , epidermal growth factor ( EGF ) , insulin , etc . In addition , the research also shows that HSPG plays an important role in the process of internalization of HSPG , which may be an important molecule in the common internal mechanism . Based on the above - mentioned recognition , this study first expressed the fusion expression of the enhanced green fluorescent protein ( EGFP ) with enhanced green fluorescent protein ( EGFP ) , and then used a series of inhibitors and fluorescent dyes associated with the internalization pathway to co - incubate the cells with the GFP protein with green fluorescence . Then , we studied the internalization pathway by fluorescence co - localization method . At last , we used the similar method to study the internalization mechanism of cytokine - inducing fragment 1 ( CIF1 ) . Finally , we used the similar method to express the fusion protein of the protein - inducing fragment 1 ( cytokine - inducing fragment 1 , CIF1 ) . In the first part , we have obtained the following conclusions . First , in the time and energy - dependent manner , in the first case , the endocytosis is internalised by the mammalian cells , and the endocytosis reaches equilibrium at 15 min . The endocytosis is distributed in the cytoplasm ; secondly , it is possible to effectively internalize the endocytosis into the cell by the endocytosis of the membrane surface HSPG , but it is not the only fragment with the internalization function on the protein . This study has made a preliminary study on the mechanism of systemic inflammatory response and has been studied , but it has been recognized that the mechanism of inflammatory response plays a key role in the pathogenesis of sepsis .

【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 ;The in vitro reconstitution of nucleosome and its binding patterns with HMG1/2 and HMG14/17 proteins[J];Cell Research;2003年05期

2 郭愛華;從全身炎癥反應(yīng)綜合征到膿毒性休克[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2002年08期

3 王松柏,姚詠明,董寧,于燕,陶國(guó)才;JAK/STAT通路介導(dǎo)膿毒癥大鼠肝組織高遷移率族蛋白B1 mRNA表達(dá)的研究[J];中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué);2003年03期

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本文編號(hào)：1439905