本文關(guān)鍵詞：RNA干擾體外抑制HBeAg表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2005年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的及意義:構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的哺乳動(dòng)物 shRNA表達(dá)載體和 HBeAg 真核表達(dá)載體,兩者共轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞,探討 shRNA表達(dá)載體對(duì) HBeAg 表達(dá)的抑制作用,為應(yīng)用 RNAi 技術(shù)治療乙型肝炎奠定一定的理論基礎(chǔ)。方法:本研究采用 PCR 方法從含有人 U6 啟動(dòng)子的載體 PTZU6+1 中擴(kuò)增 U6 啟動(dòng)子,將其克隆到 pEGFP-C1 載體中,通過(guò)限制性內(nèi)切酶、PCR 及測(cè)序?qū)?gòu)建的載體進(jìn)行鑒定,并轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞,用倒置熒光顯微鏡初步觀察綠色熒光蛋白的表達(dá);采用 PCR 的方法從質(zhì)粒 PHBV1.5 中擴(kuò)增乙肝病毒前 C/C 基因,克隆到 pCDNA3.1 的多克隆位點(diǎn)區(qū) EcoRI 和 BamHI 位點(diǎn),構(gòu)建 HBeAg 表達(dá)載體,通過(guò)酶切、PCR及測(cè)序鑒定,把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞,用 RT-PCR 檢測(cè) mRNA 的轉(zhuǎn)錄,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)HBeAg前體的表達(dá),ELISA和MEIA分別檢測(cè)細(xì)胞裂解液HBeAg 前體和培養(yǎng)上清 HBeAg 的表達(dá);把構(gòu)建的兩載體按 7∶1 的比例共轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞,用半定量 PCR 和 MEIA 分析 shRNA 表達(dá)載體對(duì) HBeAg mRMA 和蛋白質(zhì)的抑制情況;結(jié)果:經(jīng)限制性內(nèi)切酶、PCR 及測(cè)序證實(shí)已成功構(gòu)建哺乳動(dòng)物 shRNA 表達(dá)載體,該載體可以表達(dá)綠色熒光蛋白;成功構(gòu)建了 HBeAg 表達(dá)載體,該載體可以在 Hela 細(xì)胞中表達(dá) HBeAg 前體,并且可以分泌表達(dá)成熟的 HBeAg;初步篩選到 psiHBV2 載體對(duì) HBeAg的表達(dá)有一定的抑制作用,其余兩序列無(wú)抑制作用;結(jié)論:1、成功構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的哺乳動(dòng)物 shRNA 表達(dá)載體,為應(yīng)用該載體進(jìn)行 RNAi 相關(guān)研究奠定一定的基礎(chǔ);2、成功構(gòu)建乙肝病毒 HBeAg表達(dá)載體,該載體可以分泌表達(dá) HBeAg,可以勝任 RNA 干擾的靶載體;
[Abstract]:Objective and significance: to construct mammalian shRNA expression vector and HBeAg eukaryotic expression vector with green fluorescent protein reporter gene and co-transfect them into Hela cells. To investigate the inhibitory effect of shRNA expression vector on HBeAg expression. Methods: in this study, PCR was used to amplify human U6 promoter from the vector PTZU6 1 containing human U6 promoter. U6 promoter. The recombinant plasmid was cloned into pEGFP-C1 vector and identified by restriction endonuclease polymerase chain reaction and sequencing. The vector was transfected into Hela cells. The expression of green fluorescent protein was preliminarily observed by inverted fluorescence microscope. The pre-C / C gene of hepatitis B virus was amplified from plasmid PHBV1.5 by PCR. The polyclonal region of pCDNA3.1 was cloned into EcoRI and BamHI sites. The expression vector of HBeAg was constructed and identified by restriction endonuclease digestion and sequencing. The plasmid was transfected into Hela cells. The transcription of mRNA was detected by RT-PCR and the expression of HBeAg precursor was detected by immunocytochemistry. The expression of HBeAg precursor and culture supernatant HBeAg were detected by ELISA and MEIA, respectively. The two vectors were co-transfected into Hela cells at the ratio of 7: 1. The inhibition of HBeAg mRMA and protein by shRNA expression vector was analyzed by semi-quantitative PCR and MEIA. Results: the mammalian shRNA expression vector was successfully constructed by restriction endonuclease polymerase chain reaction and sequencing, which could express green fluorescent protein. HBeAg expression vector was successfully constructed, which can express HBeAg precursor in Hela cells and secrete mature HBeAg. The results showed that psiHBV2 vector could inhibit the expression of HBeAg to some extent, but the other two sequences had no inhibitory effect on the expression of HBeAg. ConclusionThe mammalian shRNA expression vector with green fluorescent protein reporter gene was successfully constructed, which laid a foundation for the application of the vector in the study of RNAi. 2. The HBeAg expression vector of hepatitis B virus was constructed successfully. The vector can secrete HBeAgand be competent for the target vector of RNA interference.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1434941