本文關(guān)鍵詞：人痘苗病毒H相關(guān)磷酸酯酶VHR小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)　出處：《華東師范大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 人痘苗病毒H1相關(guān)磷酸酯酶(Human vaccinia H1-related phosphatase，VHR)是非典型的雙位點(diǎn)特異性磷酸酯酶(dual-specificity phosphatase，DSPs)家族中的一員。VHR僅有催化結(jié)構(gòu)域，是研究DSPs結(jié)構(gòu)與功能的理想模型。它對(duì)有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成員胞外信號(hào)調(diào)控激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)進(jìn)行去磷酸化，是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)者。最近研究發(fā)現(xiàn)，VHR在眾多的腫瘤細(xì)胞株中高表達(dá)，并且通過負(fù)調(diào)控MAPK信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞的生長、分化及衰老方面起到重要作用，VHR因此成為潛在的藥物作用靶分子。 我們從原核大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達(dá)并純化得到VHR重組蛋白，通過對(duì)VHR的一系列酶學(xué)特性，包括DTT、EDTA和鹽離子濃度的影響、pH依賴性、動(dòng)力學(xué)分析及陽性抑制劑(Na_3VO_4)抑制作用分析，并優(yōu)化VHR的活性檢測方法，建立了VHR的高通量篩選(high throughput screening，HTS)模型。通過對(duì)國家化合物樣品庫中的65760個(gè)樣品進(jìn)行篩選，得到了34個(gè)抑制活性較好的化合物，其IC_(50)均低于3μg／mL。其中活性化合物Comp 1的IC_(50)為1．20μM，為結(jié)構(gòu)新穎的VHR小分子抑制劑。通過分子水平酶動(dòng)力學(xué)方法對(duì)其抑制性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該化合物為可逆的、非競爭型VHR抑制劑。通過檢測Comp 1對(duì)其它蛋白酪氨酸磷酸酯酶(Protein tyrosine phosphatases，PTPs)的選擇性，發(fā)現(xiàn)Comp 1對(duì)經(jīng)典跨膜受體型PTPs，如白細(xì)胞共同抗原(leukocyte common antigen，LCA or CD45)和白細(xì)胞共同抗原相關(guān)蛋白(leukocyte common antigen-related protein，LAR)，對(duì)經(jīng)典胞內(nèi)非受體型PTPs，包括蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)和含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1(SH-2 domain containing tyrosine phosphase 1，SHP1)，對(duì)同屬于雙位點(diǎn)特異性磷酸酯酶亞家族的細(xì)胞分裂周期25同源物A(cell division cycle 25 homolog A，CDC25A)均具有較高的選擇性，表現(xiàn)出極低的抑制活性；而對(duì)含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SH-2 domain containing tyrosine phosphase 2，SHP2)和細(xì)胞分裂周期25同源物B(cell division cycle 25 homolog B，CDC25B)具有一定的選擇性，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。 另外，我們對(duì)Comp 1細(xì)胞水平的生物活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)Comp 1能提高宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞中ERK和JNK的磷酸化水平，并能抑制宮頸癌細(xì)胞系HeLa、結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435S的生長。高劑量的Comp 1可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞周期阻滯在G2／M期，并誘導(dǎo)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡。 這一高活性、高選擇性的新型小分子VHR抑制劑的發(fā)現(xiàn)、相關(guān)抑制性質(zhì)的研究以及在細(xì)胞水平的生物活性評(píng)價(jià)，為其進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化和藥理學(xué)、藥效學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，這對(duì)于進(jìn)一步理解選擇性所依存的分子機(jī)制及尋找高效特異的PTPs抑制劑有著重要的意義，，同時(shí)也為更加廣泛地研究VHR的生理及病理功能提供了有力的工具。
[Abstract]:Human vaccinia H1-related phosphatase. VHRs are atypical dual-specificity phosphatase. VHR, a member of the DSPs family, has only a catalytic domain. It is an ideal model to study the structure and function of DSPs, which acts on mitogen-activated protein kinases. Extracellular signal-regulated kinases. ERK) and c-Jun N-terminal kinase (c-Jun N-terminal kinases-JNKK) were dephosphorylated. It is a negative regulator of MAPK signal transduction pathway. Recently, it has been found that VHR is highly expressed in many tumor cell lines and grows in tumor cells through negative regulation of MAPK signaling pathway. VHR plays an important role in differentiation and aging. The recombinant VHR protein was successfully expressed and purified from prokaryotic Escherichia coli system. The recombinant protein was expressed and purified by a series of enzymatic properties of VHR, including the concentration of VHR and salt ions. The pH dependence, kinetic analysis and inhibitory effect of VHR were analyzed, and the activity of VHR was optimized. The high throughput screening of VHR with high throughput screening was established. HTS) model. 34 compounds with good inhibitory activity were obtained by screening 65760 samples from the national compound sample bank. The ICs _ (50) of the active compound Comp _ 1 were less than 3 渭 g / mL and 1.20 渭 M. The inhibition properties of VHR were studied by enzyme kinetic method at molecular level. It was found that the compound was reversible. The protein tyrosine phosphatases of other protein tyrosine phosphatase (Comp 1) was detected by Comp 1 as a non-competitive VHR inhibitor. The selectivity of Comp 1 to classical transmembrane receptor PTPs, such as leukocyte common antigen, was found. LCA or CD45) and leukocyte common antigen-related protein. Larix, for classical intracellular non-recipient PTPs. These include protein tyrosine phosphatase 1B, protein Tyrosine Phosphatase 1B, and protein tyrosine phosphatase 1, which contains the SH2 domain. SH-2 domain containing tyrosine phosphase 1. SHP1A, a cell division cycle 25 homologue belonging to the double locus specific phosphatase subfamily, was identified as Agncell division cycle 25 homolog A. CDC25A) showed high selectivity and very low inhibitory activity. The protein tyrosine phosphatase 2H 2 domain containing tyrosine phosphase 2 contained SH2 domain. SHP2and BU cell division cycle 25 homolog CDC25B) have some selectivity. It showed strong inhibitory activity. In addition, we evaluated the biological activity of Comp 1 cells and found that Comp 1 could increase the phosphorylation of ERK and JNK in Hela cells. It can also inhibit the cervical cancer cell line HeLaand the colon cancer cell line HT-29. The growth of breast cancer cell line MDA-MB-435S. High dose of Comp 1 could induce HeLa cell cycle arrest in G 2 / M phase and induce obvious apoptosis. The discovery of this highly active and highly selective new small molecule VHR inhibitor, the study of its related inhibitory properties, and the evaluation of its biological activity at the cell level are further structural optimizations and pharmacology. The study of pharmacodynamics lays a solid foundation for further understanding the molecular mechanism of selectivity and searching for highly efficient and specific PTPs inhibitors. It also provides a powerful tool for studying the physiological and pathological functions of VHR more widely.
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1432304