本文關(guān)鍵詞：重組人巨細(xì)胞病毒嵌合肽的表達(dá)純化及活性研究　出處：《暨南大學(xué)》2005年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 重組人巨細(xì)胞病毒嵌合肽 表達(dá)載體pPICAαA 畢赤酵母 高密度發(fā)酵 親和層析 活性研究

【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染在人群中非常普遍,主要是呈隱性或亞臨床感染,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)該病毒不只在新生兒、免疫抑制及免疫缺陷患者中導(dǎo)致廣泛的臨床癥狀和死亡,而且可能與人類三大疾病--心血管疾病,惡性腫瘤及糖尿病有關(guān),因而建立HCMV的快速檢測(cè)方法具有重要意義。多種HCMV病毒蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,選用抗原性強(qiáng)、特異性好的蛋白抗原代替全病毒以檢測(cè)HCMV感染,是提高HCMV感染診斷的敏感性和特異性的有效途徑。國(guó)外的研究證實(shí),HCMV的gp52蛋白和pp150蛋白具有較強(qiáng)的抗原性,在HCMV感染者的血清中其相應(yīng)的抗體檢出率較高,本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建串連有編碼gp52 C末端和編碼pp150 C末端兩個(gè)基因片段的pPIC9K-rHCMVp表達(dá)質(zhì)粒,并在畢赤酵母獲得成功表達(dá)。但該質(zhì)粒缺少純化標(biāo)記,不利于分離純化,本研究將該質(zhì)粒中人巨細(xì)胞病毒嵌合肽(rHCMVp)基因片段導(dǎo)入帶純化標(biāo)志his6的pPICZαA中,重新構(gòu)建、篩選了表達(dá)人巨細(xì)胞病毒嵌合肽(rHCMVp)的基因工程酵母。根據(jù)其基因序列,設(shè)計(jì)引物從pPIC9K-rHCMVp上擴(kuò)增得到目的基因片段,并導(dǎo)入畢赤酵母誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICZαA中。通過(guò)電擊將線性化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115細(xì)胞中,篩選獲得表達(dá)量較高的重組菌株,研究了該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件,包括不同誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度、pH值對(duì)人巨細(xì)胞病毒嵌合肽表達(dá)的影響。2L發(fā)酵罐進(jìn)行了高密度發(fā)酵,經(jīng)1%的甲醇、pH6.0的條件下誘導(dǎo)48h,最終菌體密度OD_(600)達(dá)到180,每升發(fā)酵液中含目的蛋白78.7mg,比搖瓶提高了4.8倍的產(chǎn)量。rHCMVp嵌合肽蛋白可通過(guò)高密度發(fā)酵大量獲得。通過(guò)金屬螯合親和層析分離純化發(fā)酵液上清,獲得較高純度的rHCMVp嵌合肽蛋白,進(jìn)行了活性研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該蛋白能被抗全病毒血清檢測(cè),且具有免疫原性;與市售進(jìn)口的ELISA人巨細(xì)胞病毒檢測(cè)試劑盒相比,兩種方法的一致性較好,我們選擇的gp52和pp150兩個(gè)片段的嵌合肽蛋白作為包被抗原可用于HCMV感染的檢測(cè),為制備或組裝高特異性和敏感性的HCMV基因工程抗原試劑盒提供依據(jù)。
[Abstract]:Human cytomegalovirus (HCMV) infection is very common in the population, mainly in the form of recessive or subclinical infection. In recent years, it has been found that the virus not only causes a wide range of clinical symptoms and deaths in newborns, immunosuppressive and immunodeficient patients, but also may be associated with three major human diseases-cardiovascular disease, malignant tumor and diabetes. Therefore, it is of great significance to establish a rapid detection method for HCMV. A variety of HCMV virus proteins can stimulate the body to produce corresponding antibodies, and select strong antigenicity. It is an effective way to improve the sensitivity and specificity of the diagnosis of HCMV infection by replacing the whole virus with specific protein antigen. The gp52 protein and pp150 protein of HCMV have strong antigenicity, and the detection rate of the corresponding antibodies in the serum of HCMV infected patients is higher. We have successfully constructed a series of pPIC9K-rHCMVp expression plasmids with two gene fragments encoding the C-terminal of gp52 and the C-terminal of pp150. The plasmid was successfully expressed in Pichia pastoris, but the plasmid was not suitable for purification. In this study, the gene fragment of human cytomegalovirus chimeric peptide rHCMVpwas transferred into pPICZ 偽 A with purified his6, and was reconstructed. The recombinant yeast expressing human cytomegalovirus chimeric peptide rHCMVpwas screened. According to its gene sequence, primers were designed to amplify the target gene fragment from pPIC9K-rHCMVp. The linearized recombinant plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115 cells by electroporation. The effects of methanol concentration and pH on the expression of chimeric peptide of human cytomegalovirus (HCMV) were studied. The culture conditions of the strain were studied, including the effects of different induction time and pH value on the expression of human cytomegalovirus chimeric peptide. Under the condition of pH6.0 for 48h, the final cell density of ODS600) reached 180, and the target protein was 78.7 mg per liter of fermentation broth. Compared with shaking flask, the yield of rHCMVp chimeric peptide protein was increased by 4.8 times, which could be obtained by high-density fermentation. The supernatant of fermentation broth was separated and purified by metal chelating affinity chromatography. The high purity rHCMVp chimeric peptide protein was obtained and its activity was studied. The results showed that the protein could be detected by antiviral serum and had immunogenicity. Compared with the imported ELISA human cytomegalovirus detection kit, the two methods are consistent. We selected the chimeric peptide proteins of gp52 and pp150 as coated antigens for the detection of HCMV infection. To provide the basis for the preparation or assembly of highly specific and sensitive HCMV gene engineering antigen kit.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R373

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張玉勤;;有關(guān)人巨細(xì)胞病毒的新學(xué)說(shuō)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)情報(bào);2001年05期

2 許利軍,吳南屏;人巨細(xì)胞病毒蛋白pp71的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).流行病學(xué).傳染病學(xué)分冊(cè);2004年06期

3 謝琪璇,余巍,潘善培,肖鑾娟,彭雅林,張春雪;重組人巨細(xì)胞病毒嵌合肽基因在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)[J];中國(guó)生物工程雜志;2005年03期

4 趙俊;王明麗;;人巨細(xì)胞病毒感染對(duì)宿主細(xì)胞凋亡影響的研究進(jìn)展[J];國(guó)際病毒學(xué)雜志;2006年06期

5 鄭育聲,謝琪璇,潘善培,蘆春斌,肖鑾娟;人巨細(xì)胞病毒重組基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年06期

6 鄒俊煊,張楚瑜,游上游,金建年;Taq Man技術(shù)快速定量檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的早期感染[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版);2004年02期

7 王本旭,柳川,邵寧生,沈倍奮;人巨細(xì)胞病毒疫苗研究進(jìn)展[J];中國(guó)病毒學(xué);2005年04期

8 劉永俊,鄒文輝,李建鋒;MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與HCMV感染[J];西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年03期

9 王本旭;劉玉;劉展;高亞萍;王芳;潘和平;楊光;徐華;沈倍奮;柳川;邵寧生;;應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選人巨細(xì)胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位(英文)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2009年02期

10 謝光臨;;核酸雜交技術(shù)在人巨細(xì)胞病毒研究中的應(yīng)用[J];微生物學(xué)雜志;1992年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 齊瑩;阮強(qiáng);何蓉;盧穎;吉耀華;馬艷萍;劉慶;陳淑榮;;人巨細(xì)胞病毒UL139基因在臨床低傳代分離株中的多態(tài)性研究[A];第6次全國(guó)微生物學(xué)與免疫學(xué)大會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

2 秦紅松;劉明;孟紅;張勇;金星;;動(dòng)脈硬化閉塞癥患者動(dòng)脈人巨細(xì)胞病毒基因片段的檢測(cè)[A];全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合周?chē)芗膊W(xué)術(shù)研討會(huì)論文選編[C];2001年

3 朱俊;王世雄;張緯;胡于民;王德芬;;定量PCR檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒新技術(shù)[A];’96全國(guó)優(yōu)生科學(xué)大會(huì)大會(huì)學(xué)術(shù)講演與大會(huì)論文摘要匯編[C];1996年

4 郭紅梅;王曉紅;朱啟昒;彭亦冰;季育華;;嬰兒巨細(xì)胞病毒肝炎檢測(cè)方法的比較[A];第6次全國(guó)微生物學(xué)與免疫學(xué)大會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

5 嚴(yán)曉敏;經(jīng)者;唐勤;;人巨細(xì)胞病毒pp65DNA口服疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第14次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

6 陶開(kāi)華;李越希;汪興太;李長(zhǎng)貴;郁興明;黃培堂;;重組人巨細(xì)胞病毒gp52蛋白的純化及鑒定[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識(shí)創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊(cè)）[C];2001年

7 周東風(fēng);錢(qián)衛(wèi)疆;桂敏;孟浦;;人巨細(xì)胞病毒致造血系統(tǒng)獲得性染色體改變的臨床研究[A];湖北省遺傳學(xué)會(huì)、江西省遺傳學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2006年

8 孫崢嶸;阮強(qiáng);何蓉;馬艷平;齊瑩;吉耀華;劉慶;陳淑榮;王繼東;;人巨細(xì)胞病毒UL135基因在臨床低傳代分離株中的多態(tài)性研究[A];第6次全國(guó)微生物學(xué)與免疫學(xué)大會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

9 唐久來(lái);潘道香;許曉燕;吳德;卜笑松;;鼠孕早期感染人巨細(xì)胞病毒對(duì)仔鼠神經(jīng)行為的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十四次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

10 段群軍;陶然;胡妙鳳;尚世強(qiáng);;載體法篩選人巨細(xì)胞病毒UL122基因的高效siRNA作用靶位[A];2008年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 張中橋;人巨細(xì)胞病毒感染可致動(dòng)脈粥樣硬化[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

2 束洪福;抗人巨細(xì)胞病毒IgM膠體金快速檢測(cè)試劑研制成功[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

3 阮聞;從“五味消毒飲”到“金葉敗毒顆�！盵N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

4 熊湘非;謹(jǐn)防健康受損[N];大眾科技報(bào);2001年

5 劉婷婷;達(dá)安基因澄清利好[N];中華工商時(shí)報(bào);2007年

6 姚繼霞;三病毒致畸[N];福建科技報(bào);2001年

7 蔡曉銘;傳言爆發(fā)高潮起 多家公司忙澄清[N];證券時(shí)報(bào);2007年

8 ;CMV抗體免疫快速檢測(cè)試劑盒問(wèn)世[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

9 邱黎　通訊員 衣曉峰 本報(bào)記者;年過(guò)花甲 警惕夫妻癌來(lái)襲[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2010年

10 張秀華 葉勝舟;培養(yǎng)“訂單式”農(nóng)業(yè)人才[N];上�？萍紙�(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 喬媛;人巨細(xì)胞病毒對(duì)早孕絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞免疫功能影響的體外研究[D];華中科技大學(xué);2013年

2 王素霞;山桔顆粒對(duì)人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染抑制作用的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2003年

3 朱峰;人巨細(xì)胞病毒UL49 ORF表達(dá)及產(chǎn)物功能的初步研究[D];暨南大學(xué);2009年

4 魏國(guó)慶;人巨細(xì)胞病毒對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的感染及其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用研究[D];浙江大學(xué);2004年

5 馬強(qiáng);HCMV UL82基因重組質(zhì)粒在HFF中的表達(dá)及其Mab的制備[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2008年

6 王本旭;人巨細(xì)胞病毒M抗原表位的篩選與初步應(yīng)用研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

7 馬艷萍;人巨細(xì)胞病毒UL141基因多態(tài)性和轉(zhuǎn)錄子結(jié)構(gòu)分析以及人巨細(xì)胞病毒全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2008年

8 王波;HCMV臨床病毒株的分離及其特定基因結(jié)構(gòu)分析和表達(dá)研究[D];暨南大學(xué);2006年

9 王建寧;動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腎移植術(shù)后HCMV載量及HCMV性肺炎搶先治療的臨床研究[D];山東大學(xué);2009年

10 徐進(jìn)平;HCV E1和HCMV IE86蛋白的性質(zhì)和功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 毛敬偉;人巨細(xì)胞病毒UL82基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 常淑婷;人巨細(xì)胞病毒UL146基因-α趨化因子在巨細(xì)胞病毒感染中作用的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

3 姜永忠;人巨細(xì)胞病毒pp65單克隆抗體的制備及其體外中和活性鑒定[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2002年

4 張?jiān)Ｆ?人巨細(xì)胞病毒（HCMV）PP71基因的克隆、測(cè)序及表達(dá)研究[D];中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所;2001年

5 周海燕;人巨細(xì)胞病毒在小兒病毒性心肌炎中的臨床意義研究[D];青島大學(xué);2003年

6 楊世炳;人巨細(xì)胞病毒pp65DNA疫苗免疫小鼠的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2004年

7 何雨;高危人群HCMV和BKV感染情況的調(diào)查及其與腎病關(guān)系的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

8 樊可;重組人巨細(xì)胞病毒基因在大腸桿菌中的表達(dá)[D];大連理工大學(xué);2011年

9 吳德;人巨細(xì)胞病毒PP65基因的克隆及在CHO細(xì)胞中的表達(dá)[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2003年

10 李艷秋;人巨細(xì)胞病毒pp65 DNA疫苗的研制及其免疫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2003年

，

本文編號(hào)：1428296