本文關(guān)鍵詞：OxyR蛋白調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌抗氧化殺傷作用的研究　出處：《吉林大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 利用一步法突變技術(shù)成功構(gòu)建了鼠疫菌?oxyR突變株。為了證實(shí)鼠疫菌OxyR蛋白與H2O2抗性的相關(guān)性,我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列H2O2抗性的表型實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明oxyR基因是否表達(dá)與鼠疫菌抵抗H2O2的殺傷作用直接相關(guān)。 巨噬細(xì)胞內(nèi)存活與繁殖是鼠疫菌得以最終致病的關(guān)鍵階段。感染巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鼠疫菌野生株和?oxyR突變株感染巨噬細(xì)胞的相關(guān)的黏附吞噬率差異不顯著,說(shuō)明OxyR在鼠疫菌感染巨噬細(xì)胞的黏附過(guò)程沒(méi)有發(fā)揮明顯作用。而感染巨噬細(xì)胞吞噬率差異顯著,提示OxyR可能在鼠疫菌抵抗巨噬細(xì)胞吞噬的過(guò)程中發(fā)揮作用。 通過(guò)鼠疫菌全基因組DNA芯片,對(duì)鼠疫耶爾森氏菌H2O2刺激元和OxyR調(diào)控元進(jìn)行了的研究,H2O2刺激元轉(zhuǎn)錄譜分析結(jié)果顯示,鼠疫菌的抗氧化機(jī)制主要包括清除活性氧(katA和katY)調(diào)控元、滲透壓相關(guān)蛋白、修復(fù)DNA損傷(SOS調(diào)控元)和cys調(diào)控元等。OxyR調(diào)控元轉(zhuǎn)錄譜分析鑒定了大量OxyR調(diào)控元基因,進(jìn)一步證實(shí)了oxyR通過(guò)調(diào)控oxyR調(diào)控元發(fā)揮抗氧化作用。 結(jié)合轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果和生物信息學(xué)知識(shí),挑選了14個(gè)基因作為研究對(duì)象,在大腸桿菌中表達(dá)并純化了可溶性的OxyR蛋白后,通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)證實(shí)了OxyR蛋白能夠結(jié)合這些基因啟動(dòng)子區(qū),說(shuō)明了這些基因受OxyR調(diào)節(jié)蛋白直接調(diào)控。 利用了DNA酶I足跡實(shí)驗(yàn)和引物延伸實(shí)驗(yàn)對(duì)過(guò)氧化氫酶基因katA和過(guò)氧化物酶基因katY進(jìn)行研究,確定了OxyR蛋白結(jié)合這兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的位置和序列,以及這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新之處是通過(guò)全基因組DNA芯片,確定了鼠疫耶爾森氏菌H2O2刺激元和OxyR調(diào)控元。通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)、DNA酶I足跡實(shí)驗(yàn)和引物延伸實(shí)驗(yàn)證實(shí)了部分的OxyR調(diào)控元基因。
[Abstract]:Yersinia pestis was successfully constructed by one-step mutation technique. In order to confirm the correlation between OxyR protein and H _ 2O _ 2 resistance of Yersinia pestis, we designed a series of phenotypic experiments of H _ 2O _ 2 resistance. The results showed that the expression of oxyR gene was directly related to the killing effect of Yersinia pestis against H _ 2O _ 2. Survival and reproduction in macrophages is the key stage for Yersinia pestis to finally cause disease. The results of infected macrophages show that wild strains of Yersinia pestis and Yersinia pestis? There was no significant difference in the adhesion phagocytosis rate of macrophages infected with oxyR mutants. The results showed that OxyR did not play a significant role in the adhesion process of macrophages infected by Yersinia pestis, but the phagocytosis rate of infected macrophages was significantly different. The results suggest that OxyR may play a role in the resistance of Yersinia pestis to phagocytosis of macrophages. The H _ 2O _ 2 stimulator and OxyR regulator of Yersinia pestis were studied by using the whole genome DNA chip of Yersinia pestis. The antioxidant mechanism of Yersinia pestis mainly includes scavenging reactive oxygen species (Ros) katA and katY) regulators and osmotic pressure-related proteins. A large number of OxyR regulatory oncogenes were identified by transcriptional analysis of SOS regulators and cys regulators. It is further confirmed that oxyR exerts antioxidant effect by regulating oxyR regulatory elements. Based on the transcriptional results and bioinformatics knowledge, 14 genes were selected to express and purify soluble OxyR protein in Escherichia coli. It was confirmed by gel migration assay that OxyR proteins could bind to these gene promoter regions, indicating that these genes were directly regulated by OxyR regulatory proteins. The catalase gene katA and peroxidase gene katY were studied by DNA enzyme I footprint test and primer extension test. The position and sequence of the promoter region of OxyR protein binding to these two genes and the transcriptional initiation sites of the two genes were determined. The main innovation of this study is to identify the H2O2 stimulator and OxyR regulator of Yersinia pestis by using the whole genome DNA chip. DNA enzyme I footprint assay and primer extension assay confirmed part of the OxyR regulatory oncogene.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：1424704