本文關(guān)鍵詞：全合成人源抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗BHL-1單鏈抗體的初步篩選　出處：《吉林大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 噬菌體展示 抗體庫(kù) 單鏈抗體 人源化 雙特異抗體 篩選

【摘要】：通過(guò)抗體庫(kù)篩選針對(duì)特異抗原的噬菌體展示技術(shù)是目前獲得人源性抗體最有效的方法,抗體庫(kù)依據(jù)基因序列來(lái)源的不同,又可分為免疫庫(kù)和天然庫(kù)。利用全合成的方法可以獲得序列隨機(jī)分布的DNA文庫(kù),利用Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)公布的人抗體序列信息并結(jié)合已發(fā)表體骨架區(qū)序列,我們?cè)O(shè)計(jì)了全合成抗體庫(kù)的骨架序列和CDR3隨機(jī)區(qū)序列。根據(jù)統(tǒng)計(jì)和歸納,現(xiàn)有的人抗體的可變區(qū)基因可按重鏈和輕鏈分組,分別代表人抗體序列的七個(gè)胚系基因。其中重鏈分為VH1A、VH1B、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6;輕鏈則按Kappa鏈和Lamda鏈的不同,將Kappa鏈和Lamda鏈各分為四個(gè)組和三個(gè)組,通過(guò)輕、重鏈的組合構(gòu)成的單鏈抗體庫(kù)可以涵蓋超過(guò)95%的抗體胚系序列。在隨機(jī)化過(guò)程中,利用DNA組合固相合成法來(lái)實(shí)現(xiàn)各位點(diǎn)氨基酸種類和頻率的控制,以PCR的原理,無(wú)引物或低引物濃度來(lái)控制庫(kù)冗余度,降低差錯(cuò),經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌最終建成了1.5×109庫(kù)容的噬菌體展示文庫(kù),該抗體庫(kù)的陽(yáng)性率超過(guò)85%,正確序列超過(guò)50%,符合預(yù)期的目標(biāo)。全合成抗體庫(kù)的設(shè)計(jì)特征、構(gòu)建方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)都可以保證其實(shí)用性。為進(jìn)一步鑒定此抗體庫(kù)的效率,我們以BHL-1(抗人卵巢癌×抗人CD3雙特異抗體)蛋白為抗原,經(jīng)生物淘選獲得了數(shù)個(gè)具有較高親和力的克隆,對(duì)其中C8進(jìn)行亞克隆,轉(zhuǎn)入表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包含體為主,經(jīng)復(fù)性后進(jìn)行活性檢測(cè),對(duì)靶抗原的ELISA測(cè)定具有特異的結(jié)合能力(OD490=0.727),推測(cè)其結(jié)合位點(diǎn)在抗卵巢癌單鏈抗體部分,表明獲得了有意義的“人源化”抗體,此抗體經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化可用于測(cè)定BHL-1蛋白的樣品濃度和殘留。理論上,此抗體成庫(kù)可針對(duì)任意抗原篩選單鏈抗體,有望成為科研用抗體制備、抗體人源化的工具,經(jīng)序列優(yōu)化還可以用來(lái)制備診斷試劑或治療性中和抗體。
[Abstract]:The library was screened against specific antigen by antibody phage display technology is the method of obtaining human antibody most effective, antibody library based on gene sequences from different, can be divided into natural immune library and DNA library library. You can use the full sequence of random distribution of synthetic methods, the use of human antibody sequences Kabat database published information combined with the published sequence frame area, we designed the framework of CDR3 sequence and random sequence fully synthetic antibody library. According to the statistics and induction variable region gene of human antibody can be divided into groups according to the heavy chain and light chain, seven germline genes representing human antibody sequences. The heavy chain divided into VH1A, VH1B, VH2, VH3, VH4, VH5 and VH6; light chain according to Kappa chain and Lamda chain, Kappa chain and Lamda chain were divided into four groups and three groups by light, single chain antibody library combined heavy chain which can Covering more than 95% of the antibody germline sequence. In the randomization process, to achieve control of all amino acid types and frequency of the use of DNA combined with solid phase synthesis method, the principle of PCR, no primer or low primer concentration to control database redundancy, reduce errors, Escherichia coli by electroporation into the final of the 1.5 x 109 capacity the phage display library, the positive rate of the antibody library of more than 85%, the correct sequence of more than 50%, in line with the expected target. The design features a fully synthetic antibody library, construction method and quality control standards can ensure the practicability. For further identification of the efficiency of antibody library, we use BHL-1 (double specific antibody against human ovarian cancer * anti human CD3) protein as antigen by biopanning and obtained a number of high affinity, in which C8 was subcloned into the expression vector, and expressed in inclusion body. After renaturation of Activity detection, determination of binding ability with specific target antigens of ELISA (OD490=0.727), the binding sites in the single chain antibody against ovarian cancer, that have the meaning of "humanized" antibody, the antibody after further optimization can be used for determination of BHL-1 protein sample concentration and residue. Theoretically, this as for any screening of antigen antibody library of scFv antibody preparation, is expected to be used in scientific research, humanized antibody sequence optimization by tools, can also be used for the preparation of diagnostic reagents or treatment of neutralizing antibody.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1420460