本文關鍵詞：弓形蟲P30-P24聯(lián)合DNA疫苗的免疫保護作用及安全性評價　出處：《福建醫(yī)科大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 疫苗是防治弓形蟲病的有效手段之一,弓形蟲疫苗研制經歷了全蟲疫苗、蟲體特異組分疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗4個發(fā)展階段。弓形蟲DNA疫苗較傳統(tǒng)疫苗雖有諸多優(yōu)勢,但尚處于研究的起步階段,單價DNA疫苗可誘導機體對弓形蟲感染產生細胞免疫和體液免疫,但免疫效果并不十分理想,聯(lián)合多價DNA疫苗將是弓形蟲疫苗今后的發(fā)展趨勢。此外,弓形蟲DNA疫苗的免疫保護機制和安全性還不十分清楚,進一步探討疫苗免疫機制及其對真核細胞正�；虮磉_調控的影響,將有助于研制高效、安全、實用的弓形蟲DNA疫苗。 一、弓形蟲p30、p24 DNA疫苗pVAX1-p30、pVAX1-p24的構建及免疫功能研究 本研究利用PCR技術擴增出P30和P24基因片段,分別克隆入pVAX1載體,對重組質粒pVAX1-p30、pVAX1-p24進行PCR、雙酶切和測序鑒定;并將重組質粒pVAX1-p30、pVAX1-p24和空載體pVAX1轉染入小鼠巨噬細胞(RAW264.7),建立體外真核細胞瞬時表達系統(tǒng),應用免疫細胞化學染色(SP法)檢測表達產物p30、p24抗原蛋白;最后將pVAX1-p30、pVAX1-p24DNA疫苗經肌內注射免疫BALB/c小鼠,建立弓形蟲攻擊感染小鼠模型,觀察小鼠的生存時間,檢測血清抗弓形蟲特異性IgG抗體,ELISA法測定小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4細胞因子水平,MTT法測定免疫鼠NK細胞殺傷率,流式細胞技術測定CD4+、CD8+T細胞亞群。 結果顯示弓形蟲DNA疫苗pVAX1-p30和pVAX1-p240構建成功,并能夠在小鼠細胞巨噬細胞中表達p30、p24抗原蛋白。在弓形蟲攻擊感染小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn),pVAX1-p30+pVAX1-p24聯(lián)合免疫組BALB/c小鼠平均存活時間達到(7.60±0.74)d,與對照組(4.50±0.22)d相比明顯延長(Log Rank Statistic,P0.05);血清中抗弓形蟲特異性IgG的OD值(0.856±0.083)高于對照組(0.529±0.073)(F=17.412,P0.05);血清IFN-γ水平(853.77±66.74)pg/ml、IL-2水平(192.24±19.90)pg/ml高于對照組(598.74±67.50、89.44±10.66)pg/ml(F=20.528,F=56.393 , P 0.05) ; pVAX1-p24+pVAX1-p30組脾細胞CD4+細胞比例(37.42±4.84)%,與對照組(48.59±1.85)%間差別具有統(tǒng)計學意義(F=16.736,P0.05),CD8+細胞比例(34.94±5.30)%上升,與對照組(26.91±2.12)%差別具有統(tǒng)計學意義(F=6.896,P0.05);CD4+/CD8+淋巴細胞比值(1.09±0.19)與對照組(1.81±0.14)差別具有統(tǒng)計學意義(F=27.678,PO.05),且低于pVAX1-p24、pVAX1-p30組(1.66±0.13,1.56±0.22);NK細胞殺傷率(64.15±7.71)%,高于對照組(46.81±3.96)%及pVAX1-p24、pVAX1-p30組[(52.03±6.96)%、(55.95±7.37)%(]F=9.816, PO.05)。結果提示,弓形蟲DNA疫苗pVAX1-p30、pVAX1-p24的聯(lián)合應用對弓形蟲感染小鼠具有免疫功效,且免疫效果優(yōu)于pVAX1-p24、pVAX1-p30單獨使用,可明顯提高小鼠的細胞免疫及體液免疫水平。 二、弓形蟲p30、p24雙基因DNA疫苗pBudCE-p24-p30的構建及其對小鼠巨噬細胞基因表達譜的影響 本研究將p30、p24兩條基因片段克隆并定位于真核表達載體pBudCE4.1上,構建pBudCE-p24、pBudCE-p30以及pBudCE-p24-p30雙基因重組質粒DNA。將重組質粒pBudCE-p24、pBudCE-p30以及pBudCE-p24-p30和空載體pBudCE4.1轉染入小鼠巨噬細胞,建立體外真核細胞瞬時表達系統(tǒng),應用免疫細胞化學染色(SP法)檢測表達產物p30、p24抗原蛋白。并利用Affymetrix基因芯片研究p24及p30,特別是p24及p30協(xié)同作用對真核細胞正常基因表達調控的影響,對異常表達的基因進行檢測分析,并以RT-PCR技術對表達譜基因芯片結果進行驗證。 結果顯示重組質粒pBudCE-p24-p30、pBudCE-p24、pBudCE -p30構建成功,并能夠在小鼠細胞巨噬細胞中表達p30、p24抗原蛋白。Affymetrix表達譜基因芯片檢測發(fā)現(xiàn),雙基因DNA疫苗pBudCE-p24-p30對小鼠巨噬細胞正常基因表達調控的影響不顯著,pBudCE-p24-p30轉染后小鼠巨噬細胞共有16個基因表達出現(xiàn)上調或下調,上調的基因有Pdlim4、Pcdh7、CAMK4、Nudcd2等9個基因,下調的基因有E2F5、Rpn1、Sh3bgrl等7個基因。其中與基因轉錄有關的基因6個,與信號轉導有關的基因6個,部分功能未明的基因4個。RT-PCR檢測結果與表達譜基因芯片檢測結果完全吻合。
[Abstract]:The vaccine is one of the effective methods for preventing and treating toxoplasmosis . The vaccine of toxoplasmosis has many advantages , such as whole worm vaccine , worm - specific component vaccine , genetic engineering vaccine and DNA vaccine . Study on the Construction and Immune Function of One , Toxoplasma gondii ' s p30 , DNA Vaccine of Toxoplasma gondii ( p30 ) and DNA Vaccine ( VAX1 - p30 ) In this study , we amplified the p30 and P24 gene fragments by PCR , and cloned into mouse peritoneal macrophages ( RAW264.7 ) by PCR , double enzyme digestion and sequencing . The recombinant plasmids were then injected into mouse macrophages ( RAW264.7 ) , and the expression products were detected by immunohistochemical staining ( SP method ) . The ratio of CD4 + / CD8 + lymphocytes ( F = 16.736 , P 0.05 ) was higher in BALB / c mice than in the control group ( 8.74 鹵 67.50 , 89.44 鹵 10.66 ) pg / ml ( F = 20.528 , P 0.05 ) . The results showed that the combined application of the DNA vaccine of Toxoplasma gondii DNA vaccine and the DNA vaccine of Toxoplasma gondii has the immune function to the mice infected with toxoplasmosis , and the immune effect is better than that of the single use of the recombinant plasmid pAX1 - p30 and p30 alone , which can obviously improve the cellular immunity and humoral immunity level of the mice . Construction of p30 , p30 and pBudCE - p30 of Toxoplasma gondii and its effect on mouse macrophage gene expression profile In this study , the recombinant plasmid pBudCE4.1 , pBudCE - p30 and pBudCE4.1 were cloned into mouse macrophages to construct the eukaryotic expression vector pBudCE4.1 . The recombinant plasmid pBudCE - p30 and pBudCE4.1 were transfected into mouse macrophages to establish the eukaryotic cell transient expression system . The results showed that the recombinant plasmid pBudCE - p30 , pBudCE1 , pBudCE - p30 was constructed successfully , and the expression of p30 and pBudCE - p30 in mouse peritoneal macrophages was not significant .

【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【引證文獻】

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本文編號：1398749