本文關(guān)鍵詞：抗人CD28單鏈抗體和嵌合抗體轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及單鏈抗體基因在BmN細(xì)胞中的表達(dá)　出處：《蘇州大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： CD28 單鏈抗體 嵌合抗體 轉(zhuǎn)移載體 BmN細(xì)胞

【摘要】： CD28分子是表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白,參與介導(dǎo)T細(xì)胞活化所需的協(xié)同刺激信號(hào),屬于免疫球蛋白超家族。已有的研究表明,CD28單克隆抗體對(duì)腫瘤、自身免疫性疾病及移植排異等均具有重要的治療意義,但體內(nèi)長(zhǎng)期使用會(huì)降低治療效果。為了降低人抗鼠免疫反應(yīng),必須在臨床應(yīng)用前對(duì)CD28單克隆抗體進(jìn)行改造。本研究在對(duì)抗人CD28單克隆抗體進(jìn)行改造的基礎(chǔ)上,成功構(gòu)建了桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體,并在BmN細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。主要成果如下: 1、將抗人CD28鼠源性單抗的可變區(qū)基因和人IgG1的恒定區(qū)基因,采用一種不需要限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的新方法——三引物PCR(TP-PCR)法拼接成嵌合抗體基因,分別插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW3的ph和p10啟動(dòng)子后,成功構(gòu)建了抗人CD28的重組轉(zhuǎn)移載體pAcUW3/CD28-vH-γ_1,vL-κ。 2、采用TP-PCR法,將抗人CD28單抗的重、輕鏈可變區(qū)基因和人工設(shè)計(jì)的昆蟲(chóng)桿狀病毒多角體蛋白基因偏好的連接肽序列,拼接成抗人CD28單鏈抗體基因,并將其插入昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8的ph基因啟動(dòng)子后,構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8/CD28-ScFv�；蚱唇訒r(shí),在抗體鏈段的C端增加了6×His tag序列,便于表達(dá)產(chǎn)物的純化。 3、采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8/CD28-ScFv和線性化的Bm-BacPAK6共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞,利用空斑分析以及藍(lán)白斑篩選相結(jié)合的方法,篩選出重組桿狀病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv,并用PCR方法對(duì)此重組病毒進(jìn)行了鑒定。 4、將重組病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv接種BmN細(xì)胞,定期收取感染細(xì)胞,并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blotting分析。結(jié)果表明,在分子量約為28kD處有一清晰的亮帶,說(shuō)明抗人CD28單鏈抗體基因在BmN細(xì)胞中得到了特異性表達(dá)。表達(dá)始于24h,表達(dá)峰在72h。 抗人CD28單鏈抗體和嵌合抗體基因轉(zhuǎn)移載體的成功構(gòu)建及抗人CD28單鏈抗體基因在BmN細(xì)胞中的表達(dá)為抗人CD28基因工程抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:CD28 molecules are transmembrane glycoproteins expressed on the surface of T lymphocytes. They are involved in the costimulatory signals required to mediate the activation of T cells and belong to the immunoglobulin superfamily. CD28 monoclonal antibody has important therapeutic significance for tumor, autoimmune disease and transplantation rejection, but long-term use in vivo will reduce the therapeutic effect. In order to reduce the human anti-mouse immune response. CD28 monoclonal antibody must be modified before clinical application. In this study, baculovirus transfer vector was successfully constructed on the basis of anti-human CD28 monoclonal antibody modification. And expressed in BmN cells. The main results are as follows: 1. The variable region gene of mouse monoclonal antibody against human CD28 and the constant region gene of human IgG1. A new method, which does not require restriction endonuclease and ligase, was used to splice the chimeric antibody gene into the chimeric antibody gene. After inserting ph and p10 promoters of baculovirus transfer vector pAcUW3, the recombinant transfer vector pAcUW3 / CD28-vH- 緯 1 was successfully constructed. VL- 魏. 2. Using TP-PCR method, the weight, light chain variable region gene of anti human CD28 monoclonal antibody and the preferentially linked peptide sequence of insect baculovirus polyhedrosis protein gene were sequenced. Splicing the single chain antibody gene against human CD28 and inserting it into the ph gene promoter of insect baculovirus transfer vector pBacPAK8. The recombinant transfer vector pBacPAK8 / CD28-ScFv. was constructed. When the gene was spliced, 6 脳 His tag sequence was added to the C end of the antibody chain, which was convenient for the purification of the expressed product. 3Recombinant transfer vector pBacPAK8/CD28-ScFv and linearized Bm-BacPAK6 were co-transfected into BmN cells by liposome-mediated method. The recombinant baculovirus Bm-BacPAK6 was screened by the combination of plaque analysis and blue and white spot screening. The recombinant virus was identified by PCR method. 4Recombinant virus Bm-BacPAK6 CD28-ScFv was inoculated into BmN cells and infected cells were collected regularly. The results of SDS-PAGE and Western Blotting analysis showed that there was a clear bright band at the molecular weight of about 28kD. The results showed that the anti-human CD28 single-chain antibody gene was specifically expressed in BmN cells, and the expression began at 24 h, and the expression peak was 72 h. Construction of anti-human CD28 single-chain antibody and chimeric antibody gene transfer vector and expression of anti-human CD28 single-chain antibody gene in BmN cells laid the foundation for the development of anti-human CD28 gene engineering antibody. Base.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：Q789;R392

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本文編號(hào)：1396105