本文關(guān)鍵詞：溶瘤單純皰疹病毒mtHSV的小鼠肉瘤治療及其免疫機制研究　出處：《武漢大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類生命健康,目前它已經(jīng)超過心腦血管疾病而躍居為人類致死疾病的首位。全世界每年死于惡性腫瘤的人數(shù)超過700萬,僅在我國每年新發(fā)腫瘤病人達(dá)200余萬,死亡約160萬人。對于大多數(shù)種類的腫瘤,仍在沿用傳統(tǒng)療法如手術(shù)、放療、化療等進(jìn)行治療,然而面對很多惡性腫瘤,傳統(tǒng)療法顯得束手無策。而基因治療方案至今在臨床治療中仍然沒有實質(zhì)上的突破。 二十世紀(jì)九十年代,隨著分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)及病毒學(xué)本身的發(fā)展,腫瘤發(fā)生的分子機制,細(xì)胞與病毒間的作用機制,信號傳導(dǎo)通路,凋亡抑制與誘發(fā)機制等逐漸被闡明,用病毒治療腫瘤成為研究的熱點。這種能選擇性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制,并進(jìn)一步殺滅腫塊,被稱為條件性復(fù)制病毒或選擇性復(fù)制病毒(conditional replicative viruses),或溶瘤病毒(oncolytic viruses)。本室構(gòu)建的缺失凋亡抑制基因icp34.5并插入LacZ基因的單純皰疹病毒(mtHSV)就是一種有靶向性的溶瘤病毒。一般說來,蛋白激酶R(PKR)介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)和翻譯起始因子eIF-2α的失活,導(dǎo)致蛋白翻譯的抑制,細(xì)胞凋亡。WtHSV-1的ICP34.5C-末端可以和蛋白磷酸酶I(PP1)結(jié)合,使eIF-2α去磷酸化而成為活性蛋白,保證蛋白質(zhì)合成繼續(xù),病毒復(fù)制得以完成。但在很多腫瘤細(xì)胞中,很可能是由于IFN-PKR信號傳導(dǎo)途徑的缺陷,eIF-2α不能磷酸化而成為活性態(tài),細(xì)胞得以生存,因此,這條信號通路不能引發(fā)這些腫瘤細(xì)胞凋亡。因此,即使缺失icp34.5基因的HSV-1病毒(mtHSV)也能在IFN-PKR缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制,并在復(fù)制后以溶瘤方式釋放病毒,殺死腫瘤細(xì)胞。由于icp34.5是一個凋亡抑制基因,又對eIF-2α有激活功能,因此,icp34.5的缺失,mtHSV在感染正常細(xì)胞時,由于正常細(xì)胞的凋亡,mtHSV不能復(fù)制,所以,mtHSV對正常細(xì)胞是安全的。體外細(xì)胞水平我們已經(jīng)證明mtHSV選擇性的在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制,而在正常細(xì)胞中不復(fù)制。動物水平mtHSV被證明在荷Hep3B肝癌裸鼠和荷小鼠肉瘤S-180細(xì)胞Balb/c鼠中治療腫瘤是有效的,而且對正常組織無毒副作用。 一般認(rèn)為,1型單純皰疹病毒(HSV-1)對多數(shù)人只引起反復(fù)發(fā)作的溫和感染,極少威脅到人的生命。但是一個不可回避的事實是HSV-1一般傳播的非�？焖俸蛷V泛。HSV-1對人的潛伏感染的時間是非常長的,一般初次感染沒有癥狀。據(jù)統(tǒng)計,60-90 %的人受過HSV-1不同程度的感染,許多腫瘤病人的血清在mtHSV治療前是HSV陽性的,因而抗體和白細(xì)胞等會有效地阻止和清除HSV的再次感染。mtHSV對腫瘤治療已經(jīng)證明是有效的,但是HSV-1血清陽性個體的腫瘤治療還未曾研究。因此,我們深入地研究了mtHSV對HSV預(yù)免疫的血清陽性Balb/c鼠的腫瘤治療效果。Balb/c鼠用mtHSV或野生型HSV-1 F腹腔注射免疫,隨后將HSV免疫后的HSV(mtHSV和wtHSV-1)血清陽性鼠和正常小鼠在左肢腋下建立小鼠肉瘤模型,然后用mtHSV瘤內(nèi)注射治療腫瘤。野生型HSV-1 F免疫鼠經(jīng)mtHSV治療后腫瘤平均生長率被極大地抑制,達(dá)到76.07 %,平均生存期也被顯著延長,小鼠生存率提高62.5 %,與mtHSV治療的mtHSV免疫鼠和正常鼠比較起來均有顯著差異。我們得出結(jié)論:體內(nèi)存在HSV的感染不會削弱反而會增強mtHSV治療腫瘤的效果。這種結(jié)果可能在mtHSV腫瘤臨床治療上有潛在應(yīng)用價值。 為了闡明其中的關(guān)系,我們進(jìn)一步研究了未免疫和HSV血清陽性Balb/c鼠外周血淋巴細(xì)胞體外對S-180的細(xì)胞毒性作用及PBMC在免疫過程中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化。IFN-γ產(chǎn)生于抗原激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞,它扮演了涉及到抗病毒和抗腫瘤功能的免疫調(diào)節(jié)角色和效應(yīng)因子功能,包括誘導(dǎo)CTL(cytotoxic T lymphocytes)細(xì)胞、NK細(xì)胞和吞噬細(xì)胞依賴的活性的激活。TNF-α是大多數(shù)免疫功能的主要調(diào)節(jié)分子,是一個細(xì)胞毒性作用的單一因子,包括誘導(dǎo)凋亡、腫瘤細(xì)胞的裂解、多型核細(xì)胞(polymorph nuclear leukocytes,PMN)和抗病毒活性。TRAIL與其它TNF家族成員一樣能夠誘導(dǎo)其敏感靶細(xì)胞凋亡。最近的報道表明TRAIL在激活的人和鼠的T淋巴細(xì)胞表面表達(dá),提高了TRAIL對T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用或免疫調(diào)節(jié)的可能性。未免疫和HSV血清陽性Balb/c鼠的PBMC體外對S-180細(xì)胞的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明野生型HSV血清陽性鼠的PBMC在體外對S-180細(xì)胞的細(xì)胞毒性達(dá)到22.3 %,mtHSV血清陽性鼠的為11.4 %,未免疫鼠的為0.5 %。實驗證明HSV免疫小鼠確實誘導(dǎo)產(chǎn)生了腫瘤特異性或非特異性因子,可能包括NK細(xì)胞(natural killer cell)和LAK細(xì)胞(lymphokine activated killer cell),這些腫瘤特異性或非特異性因子在mtHSV介導(dǎo)的腫瘤治療中與mtHSV一起協(xié)同殺死了腫瘤細(xì)胞,HSV-1F免疫小鼠的這種作用強于mtHSV免疫小鼠。HSV血清陽性Balb/c鼠在免疫過程中PBMC的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平檢測實驗表明HSV血清陽性鼠PBMC的干擾素gamma轉(zhuǎn)錄水平在感染的早期和晚期均顯著的升高,晚期達(dá)到了本底的4-5倍,而在野生型HSV血清陽性鼠中腫瘤壞死因子alpha的轉(zhuǎn)錄水平在感染晚期比本底也升高了1.5倍。干擾素具有廣譜的抗病毒活性,表現(xiàn)在病毒繁殖量的減少以及由此而引起的細(xì)胞損傷的減少。干擾素的抗病毒作用是抑制,而不是殺滅病毒。不同病毒對干擾素作用的敏感性也不同。據(jù)報道IFN-γ通過PKR途徑阻止HSV-1復(fù)制。但HSV-1編碼的三種蛋白質(zhì)ICP0 , ICP34.5和USll,對IFN抑制病毒復(fù)制有明顯的抵消作用。ICP34.5與細(xì)胞蛋白磷酸酶1結(jié)合,能夠逆轉(zhuǎn)PKR(蛋白激酶)的活性。USll是RNA結(jié)合蛋白,它可以防止PKR的激活。PKR是IFN誘導(dǎo)激酶,它可以抑制蛋白質(zhì)的合成,主要是通過磷酸化翻譯起始因子2 (eIF-2 )起作用。ICPO能夠抑制IFN-γ誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄,其機制未知。mtHSV雖然缺失了ICP34.5,但它是腫瘤靶向性的,而這些腫瘤細(xì)胞的PKR途徑都是失活的,因此,IFN-γ不能通過PKR途徑來抑制mtHSV在這些腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制。而且IFN-γ抗病毒活性較IFNⅠ型低,但它的免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞增殖的作用較強,它是一種強的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞活化劑,能激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其活性;能直接作用于T和B淋巴細(xì)胞,促進(jìn)分化,通過免疫調(diào)節(jié)來抑制和殺死腫瘤細(xì)胞�？傊�,機體由于預(yù)先感染mtHSV或HSV-1F產(chǎn)生的IFN-γ不會抑制隨后注射的mtHSV在腫瘤中的復(fù)制,反而會由于產(chǎn)生的IFN-γ來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)抑制和殺死腫瘤細(xì)胞。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的淋巴因子。實驗表明TNF對多種腫瘤細(xì)胞有較強的細(xì)胞毒性作用;動物實驗顯示TNF對小鼠肉瘤、腺瘤均有明顯抗瘤效果,特征是引起腫瘤出血性壞死,腫瘤縮小以至消退,肺轉(zhuǎn)移減少和動物存活期延長。TNF抗瘤作用主要機制是:(1)引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。腫瘤細(xì)胞膜TNF受體收到配體的信號后,通過死亡受體途徑使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡;(2)對腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性。TNF與腫瘤細(xì)胞膜TNF受體特異性結(jié)合并內(nèi)吞,與溶酶體結(jié)合發(fā)生溶酶體破裂,導(dǎo)致細(xì)胞自溶;(3)引起腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,血栓形成,導(dǎo)致腫瘤缺血性壞死。IFN-γ可以通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞TNF-α表達(dá),增加TNF受體數(shù)量來提高腫瘤細(xì)胞對TNF的敏感性。我們得出結(jié)論在野生型HSV血清陽性鼠中IFN-γ和TNF-α在抗腫瘤的功能中扮演了比較重要的角色,在mtHSV血清陽性鼠中IFN-γ起著重要作用。 mtHSV治療腫瘤已經(jīng)被證明是有效的,但是結(jié)合其他化療藥物治療腫瘤還未曾研究。溶瘤病毒聯(lián)合化療藥物或放療治療癌癥能夠很大程度地提高治療效果,減少治療過程中對機體本身的毒副作用。表阿霉素EPI已經(jīng)在病人身上進(jìn)行了廣泛的研究,并且被證明對腫瘤治療是有效的。mtHSV和EPI在細(xì)胞水平具有協(xié)同治療腫瘤的療效。我們在Balb/c小鼠左前肢掖下植入肉瘤,然后將mtHSV高濃度,EPI正常劑量,mtHSV中濃度+EPI低劑量或者PBS瘤內(nèi)注射治療小鼠,每周一次持續(xù)三周。與用PBS,mtHSV或者EPI治療組相比較,mtHSV+EPI治療組的小鼠體內(nèi)腫瘤平均生長率明顯受到極大的抑制,腫瘤抑制率達(dá)到86.10 %。在實驗期間,mtHSV+EPI治療組,EPI治療組,mtHSV治療組,PBS治療組的小鼠存活率分別是100 %,87.5 %,100 %,25 %。從免疫組織化學(xué)和小鼠腫瘤組織病理切片看,mtHSV+EPI治療組的腫瘤壞死程度最大,PBS治療組的腫瘤組織仍然是致密的。常規(guī)和生化的血液結(jié)果表明,EPI對機體有微弱的毒性,但是mtHSV聯(lián)合EPI治療腫瘤對機體幾乎沒有毒性。我們推論:在腫瘤治療中,低劑量的mtHSV和EPI聯(lián)合治療可以協(xié)同增強放大二者高劑量單個使用抗腫瘤的效果,在提高腫瘤治療效果的同時大大降低化療藥物EPI對機體本身的毒副作用性并且mtHSV在腫瘤組織內(nèi)的復(fù)制能力沒有被EPI所削弱。
[Abstract]:Cancer is a serious hazard to human life . It has already surpassed cardiovascular and cerebrovascular diseases . It has been the first to kill human fatal diseases . The world has more than 7 million people dying every year , with about 1.6 million deaths per year . For most kinds of tumors , traditional therapy is still in the end . But in the face of many malignant tumors , the traditional therapy seems to be ineffective . And the gene therapy program still has no substantial breakthrough in clinical treatment .






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