本文關(guān)鍵詞：肉毒毒素與蛋白受體相互作用的分子基礎(chǔ)及其應用的研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2007年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 肉毒毒素(Clostridium botulinum neurotoxin,BoNT)通過與靶細胞表面受體特異結(jié)合，在受體介導的胞吞作用下內(nèi)化進入細胞發(fā)揮強神經(jīng)毒性作用。其中，肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)與其靶細胞表面受體的特異結(jié)合是決定毒素分子毒性發(fā)生的關(guān)鍵起始步驟。研究表明，肉毒毒素Hc片段是其受體結(jié)合區(qū)(Receptor Binding Domain，RBD)，SynaptotagminsⅡ(sytⅡ)是新近研究發(fā)現(xiàn)的肉毒素素特異蛋白受體。目前對肉毒毒素與其受體相互作用的分子基礎(chǔ)還缺乏足夠的了解，尋找和鑒定在肉毒毒素與蛋白受體相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)基序?qū)⒂兄诮沂救舛径舅氐姆肿又虏C制，為肉毒毒素的特異性防治研究提供新的思路。本論文針對肉毒毒素與靶細胞相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要進行了三部分研究。 具體研究結(jié)果如下： 一、肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)的主要抗原表位的研究 針對肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)，采用生物信息學對其抗原表位進行綜合分析及預測，并通過計算機模擬技術(shù)設(shè)計合成模擬表位肽，對其免疫學效應進行評價，同時利用噬菌體展示技術(shù)篩選針對模擬表位肽的特異結(jié)合短肽，評價噬菌體展示肽封閉特定抗原表位的毒素毒性中和能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)抗原表位的分布存在血清型的差異性，A型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)抗原表位分布較為寬泛，存在分散的多個優(yōu)勢抗原表位，主要位于片段1110-1172及1260-1295，實驗結(jié)果還顯示不同表位間存在協(xié)同保護作用；而B型肉毒毒素抗原表位的分布更為集中，主要位于受體結(jié)合區(qū)末端約四分之一的區(qū)域(1183-1291)。抗原表位的確定為肉毒毒素的防治提供明確的藥物靶標，同時表位的分布特征也為不同血清型肉毒毒素抗毒素的研究策略提供了實驗依據(jù)。 二、肉毒毒素與特異蛋白受體sytⅡ相互作用結(jié)合位點的鑒定 針對新近發(fā)現(xiàn)的肉毒毒素蛋白受體sytⅡ，首先進行重組制備獲得可溶性受體sytⅡ-LD，分析其與不同血清型肉毒毒素及其Hc片段的結(jié)合活性，結(jié)果顯示，可溶性受體可與B型肉毒毒素及其Hc片段特異結(jié)合，而與其他血清型沒有結(jié)合，，表明可溶性受體與B型肉毒毒素Hc片段的結(jié)合是特異的。應用Biacore SPR技術(shù)對可溶性受體與重組BHc蛋白的特異結(jié)合活性進行動態(tài)分析，測定親和力為2.99×10~(-7)M。進一步對可溶性受體與B型肉毒毒素優(yōu)勢模擬表位肽的相互作用進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組功能受體能與P7、P8模擬表位肽特異結(jié)合，提示它們可能共同構(gòu)成毒素的受體結(jié)合位點(1235-1291)。同時根據(jù)SytⅡ氨基端泡內(nèi)區(qū)氨基酸序列，化學合成了兩段重疊受體肽，通過與肉毒毒素重組BHc的特異識別結(jié)合，初步確定SytⅡ-LD的毒素特異結(jié)合域為G37-K50。 三、功能蛋白受體的肉毒毒素毒性拮抗效應研究 應用肉毒毒素敏感細胞及小鼠模型，分析肉毒毒素特異蛋白受體的毒素拮抗效應，免疫熒光結(jié)果顯示，可溶性受體sytⅡ-LD能與細胞膜受體競爭結(jié)合肉毒毒素，減少結(jié)合到SytⅡ~+ PC12細胞上的毒素。動物保護實驗結(jié)果顯示，可溶性受體sytⅡ-LD融合蛋白具有劑量依賴的毒素抑制作用，濃度達到270μg／mL時，小鼠存活率為25％。雙受體是否存在協(xié)同作用?結(jié)果顯示，單獨使用神經(jīng)節(jié)苷脂未發(fā)現(xiàn)明顯的保護作用，但可以顯著增強蛋白受體SytⅡ-LD與毒素的相互作用，提高蛋白受體SytⅡ-LD的毒素拮抗效應，同樣劑量條件下小鼠存活率達到60％；在此基礎(chǔ)上，利用linker序列將肉毒毒素受體片段與抗B型肉毒毒素ScFv連接，構(gòu)建ScFv-SytⅡ-LD雙功能分子，所構(gòu)建的雙功能分子能夠明顯抑制毒素毒性，其抑制活性比單獨可溶性受體sytⅡ-LD有明顯提高，雙功能活性增強了母本可溶性受體或抗體的毒素特異靶向性，提高毒素毒性拮抗效應，有效延長了小鼠發(fā)病和死亡的時間。 以上研究為進一步加深對肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)分子結(jié)構(gòu)的認識，探討肉毒毒素與宿主細胞受體相互作用的分子致病機制奠定了良好的基礎(chǔ)，同時為肉毒毒素的特異性防治研究提供了新的思路以及作用明確的藥物靶標。
[Abstract]:Botulinum toxin (Clostridium botulinum, neurotoxin, BoNT) by binding to specific cell surface receptor, in receptor-mediated endocytosis internalized into cells exert neurotoxic effects. Among them, botulinum toxin receptor binding region and target specific cell surface receptor binding is a key initial step decision. Toxin molecular toxicity study show that botulinum toxin Hc fragment is the receptor binding region (Receptor Binding, Domain, RBD), Synaptotagmins II (syt II) is a recently discovered botulinum toxin specific protein receptor. There is a lack of adequate understanding of the molecular basis of botulinum toxin receptor interaction, molecular mechanism and structure identification based search play a key role in botulinum toxin and protein receptor interactions in order to help reveal the botulinum toxin, the prevention and control of the specificity of botulinum toxin research to provide a new This paper focuses on three key parts of the interaction between botulinum toxin and target cells.
The results of the study are as follows:
A study of the major epitopes of the binding region of botulinum toxin receptor
The botulinum toxin receptor binding region, using bioinformatics of its epitope was analyzed and predicted by using the computer simulation technology, design and synthesis of mimotope peptide, evaluate its immunological effect, at the same time using phage display specific mimotopes of binding peptides, phage display peptide closed evaluation cytotoxin specific epitope neutralization ability, the results showed that A, the difference of botulinum toxin type B receptor binding region epitope existing serotypes of botulinum toxin type A receptor binding epitope distribution is relatively broad, dispersed multiple epitope fragment and 1110-1172 mainly located in the 1260-1295, the experimental results also showed that different epitopes has synergetic protective effect; and the distribution of botulinum toxin type B antigen epitope is more concentrated, mainly located in the receptor binding region at the end of about four points One area (1183-1291). The determination of antigen epitopes provides a clear target for the prevention and treatment of botulinum toxin. Meanwhile, the distribution characteristics of epitopes provide experimental evidence for different botulinum toxin antitoxin research strategies.
Two, identification of binding sites for the interaction of botulinum toxin and specific protein receptor syt II
According to the newly discovered botulinum toxin syt protein receptor II, first prepared recombinant soluble receptor syt II -LD analysis of binding activity with different serotypes of botulinum toxin and its Hc fragment showed that soluble receptors can be combined with botulinum toxin B and Hc specific fragment, not combined with other serum according to type, soluble receptor and type B botulinum toxin Hc fragment is specific. The specific application of Biacore SPR technology of soluble recombinant BHc protein and receptor binding activity for dynamic analysis, determination of the affinity of 2.99 * 10~ (-7) M. of soluble receptor and botulinum toxin type B advantage to simulate the interaction between epitopes peptide analysis, results showed that the recombinant receptor function with P7, P8 epitope specific binding peptide, indicating that they may constitute the toxin receptor binding site (1235-1291). At the same time, according to the Syt - II The amino acid sequences in the end vesicle region were chemically synthesized, and the two overlapping receptor peptides were synthesized. By combining with the specific recognition of recombinant BHc of botulinum toxin, the toxin specific binding domain of Syt II -LD was preliminarily determined to be G37-K50..
Three, study on the toxic antagonism of botulinum toxin of functional protein receptor
The use of botulinum toxin sensitive cells and mice model, analysis of toxin antagonistic effect of botulinum toxin specific protein receptor, immunofluorescence results showed that the soluble receptor syt II -LD and cell membrane receptor competitive binding of botulinum toxin, reduce the binding to Syt II + PC12 cells of toxins. Animal experimental results showed that the soluble receptor syt II -LD fusion protein has a dose-dependent inhibitory effect of melittin, the concentration reached 270 g / mL, the survival rate of mice was 25%. double receptor whether there is a synergistic effect? Results show that ganglioside used alone without obvious protective effect, but can significantly enhance the interaction between -LD and Syt II receptor protein toxins, improve antagonistic effect of Syt toxin protein receptor II -LD, the same dose conditions, the survival rate of mice reached 60%; on this basis, using linker sequence of botulinum toxin receptor fragment with anti type B meat Toxin ScFv connection, construct ScFv-Syt II -LD bifunctional molecule, bifunctional molecule constructed can inhibit the toxicity, the inhibitory activity was obviously higher than single soluble receptor syt II -LD bifunctional activity enhanced toxin specific targeting maternal antibody or soluble receptor to enhance toxicity, antagonistic effect, prolong the mice of morbidity and mortality.
The above research to further deepen the understanding of the molecular structure of binding region of botulinum toxin receptor, has laid a good foundation to explore the molecular mechanism of botulinum toxin and host cell receptor interaction, and provides ideas and drug clear new target of specific prevention of botulinum toxin.

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346

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