本文關(guān)鍵詞：人FAT10與PRAK的相互作用研究　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理／病理過(guò)程。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞已發(fā)現(xiàn)5個(gè)MAPK亞族：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1和2，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)1、2和3，p38α、β、γ、δ，ERK3和4，以及ERK5。MAPK的廣泛生物學(xué)作用通過(guò)磷酸化各種底物如磷脂酶(phospholipase)、轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞骨架蛋白等而實(shí)現(xiàn)。MAPK也可以催化并激活一些蛋白激酶，稱為MAPK激活的蛋白激酶(MAPK-activated protein kinase，MK)，包括核糖體S6蛋白激酶(ribosomal S6 kinase，RSK)、絲裂原和應(yīng)激激活的蛋白激酶(mitogen-and stress-activated kinase，MSK)、MAPK相互作用蛋白激酶(MAPK interacting kinase，MNK)、MK2和3、MK5。不同的MAPK亞族通過(guò)激活不同的MK介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能。 p38調(diào)節(jié)激活的蛋白激酶(p38-regulated／activated protein kinase，PRAK)又稱為MK5，，最初是從數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)MK2進(jìn)行同源序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的。由于PRAK是MK家族中相對(duì)較新的一個(gè)成員，對(duì)其激活機(jī)制及功能知之甚少。 最初研究發(fā)現(xiàn)，PRAK的Thr~(182)能夠被p38α和p38β磷酸化而激活，激活的PRAK通過(guò)磷酸化并激活熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)發(fā)揮生物學(xué)作用。然而，近來(lái)有研究認(rèn)為p38在體外或體內(nèi)過(guò)表達(dá)時(shí)磷酸化PRAK，但在生理狀態(tài)下激活p38級(jí)聯(lián)并不能顯著增加PRAK活性，而PRAK也不能有效地激活HSP27。以上相互矛盾的結(jié)果表明需要進(jìn)行更多的研究以明確PRAK的激活機(jī)制及其功能。 為了進(jìn)一步了解PRAK的相互作用蛋白及其生物學(xué)功能，我們實(shí)驗(yàn)室前期利用一種新的篩選技術(shù)T7噬菌體展示系統(tǒng)(T7 phage display system)篩選了與PRAK相結(jié)合的蛋白。經(jīng)過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)FAT10可能是一個(gè)與PRAK相互作用的蛋白。 FAT10是一種泛素樣修飾因子(ubiquitin like modifier, UBL)。其編碼基因定位于Ⅰ型人主要組織相容性復(fù)合體(human maior histocompatibility complex classⅠ, MHCⅠ)基因座。目前關(guān)于FAT10的性質(zhì)及其功能作用知之甚少，認(rèn)為FAT10雖然由位于編碼MHCⅠ基因座的基因編碼但是可能并不參與抗原的呈遞。作為一種短壽蛋白，F(xiàn)AT10在細(xì)胞內(nèi)能夠迅速被蛋白酶體降解，并且介導(dǎo)與其融合的蛋白降解，而這個(gè)降解過(guò)程不依賴于泛素。有關(guān)FAT10對(duì)細(xì)胞凋亡的影響尚有爭(zhēng)議，不同實(shí)驗(yàn)室選擇不同來(lái)源的細(xì)胞所得到的結(jié)果不一致。新近有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10能夠與有絲分裂停滯蛋白2(mitotic arrest deficient 2, MAD2)在有絲分裂期相互作用，從而影響細(xì)胞周期的調(diào)控，過(guò)表達(dá)的FAT10會(huì)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和多形核出現(xiàn)。 為了有效地了解FAT10與PRAK之間相互作用介導(dǎo)的功能，我們首先對(duì)FAT10的性質(zhì)進(jìn)行了初步探討。 我們構(gòu)建了帶Flag標(biāo)簽和紅色熒光蛋白(red flurourence protein, RFP)標(biāo)簽的FAT10表達(dá)質(zhì)粒。我們將pcDNA3-Flag-FAT10轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，用抗-Flag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，除了檢測(cè)到一條特異性的分子量為20 kD左右的條帶(單體FAT10)，還檢測(cè)到一條約36kD的結(jié)合條帶以及更大分子量的結(jié)合條帶，提示FAT10在HEK293細(xì)胞內(nèi)能夠與自身或者其它蛋白形成共價(jià)復(fù)合物。另外我們發(fā)現(xiàn)Flag-FAT10及其36 kD結(jié)合產(chǎn)物在正常培養(yǎng)條件下隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量遞減，而給予饑餓處理后隨時(shí)間延長(zhǎng)反而增加，36 kD分子量共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物與單體變化趨勢(shì)一致，但是更大分子量的結(jié)合產(chǎn)物卻是隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，不受饑餓處理的影響。這些結(jié)果提示正常培養(yǎng)情況下，F(xiàn)AT10及其36kD共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物可能會(huì)迅速被降解。另一方面，當(dāng)轉(zhuǎn)染FAT10的細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下FAT10蛋白量反而增加提示可能細(xì)胞在正常狀態(tài)下存在某種機(jī)制能夠降解FAT10，但是當(dāng)處于饑餓狀態(tài)時(shí)，這種機(jī)制就遭到破壞，于是FAT10降解途徑被阻斷，F(xiàn)AT10在細(xì)胞中蓄積。 我們進(jìn)而采用了XTT比色法和檢測(cè)基因組DNA ladder的方法比較了正常培養(yǎng)狀態(tài)和饑餓狀態(tài)下，過(guò)表達(dá)FAT10的HEK293細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。XTF檢測(cè)結(jié)果提示，F(xiàn)AT10過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下存活率明顯低于對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P＜0.05)。當(dāng)細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)時(shí)，過(guò)表達(dá)FAT10的HEK293細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)DNAladder現(xiàn)象，而正常條件培養(yǎng)的FAT10過(guò)表達(dá)細(xì)胞以及正常條件培養(yǎng)和饑餓狀態(tài)下轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞則無(wú)此現(xiàn)象發(fā)生，這與XTT結(jié)果是一致的，提示FAT10在細(xì)胞饑餓狀態(tài)下能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而正常培養(yǎng)條件下則對(duì)細(xì)胞凋亡影響不明顯。 另外，我們用紅色熒光蛋白示蹤的方法觀察了外源性FAT10在HEK293細(xì)胞中的定位情況及其對(duì)各種刺激的反應(yīng)。正常情況下過(guò)表達(dá)的RFP-FAT10在HEK293細(xì)胞中分布并不一致，部分細(xì)胞FAT10彌散分布在胞質(zhì)胞核中；部分在胞質(zhì)胞核均有表達(dá)，但是在胞核中呈現(xiàn)粗大明亮的顆粒；刺激劑如LPS、高滲、亞砷酸鈉等對(duì)已表達(dá)的FAT10分布沒(méi)有明顯影響。上述結(jié)果提示FAT10的表達(dá)及亞細(xì)胞定位可能與細(xì)胞周期有關(guān)。 在探討FAT10功能特性的同時(shí)，我們進(jìn)行了FAT10與PRAK相互作用的體外體內(nèi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及二者在HEK293細(xì)胞中的共定位研究。首先我們構(gòu)建了帶6個(gè)組氨酸(histidine，His)的FAT10原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)純化了His-FAT10和GST-PRAK蛋白，并進(jìn)行了體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明FAT10和PRAK在體外存在特異性結(jié)合。 隨后我們將pcDNA3-Flag-FAT10和pcDNA3-HA-PRAK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至NIH3T3細(xì)胞，用免疫共沉淀的方法檢測(cè)了二者在真核細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合。將共表達(dá)Flag-FAT10和HA-PRAK的細(xì)胞裂解上清與M2微珠孵育后，用抗Flag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)36 kD的Flag-FAT10結(jié)合條帶消失，而并沒(méi)有見(jiàn)到代表泛素化的典型的階梯狀條帶。同樣處理的樣品用抗HA抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)沒(méi)有檢測(cè)到特異性的HA-PRAK條帶。共表達(dá)Flag-FAT10和HA-PRAK的細(xì)胞裂解上清與抗HA磁珠孵育后，用抗Flag抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，沒(méi)有檢測(cè)到特異性的Flag-FAT10條帶，用抗HA抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，也沒(méi)有檢測(cè)到典型的階梯狀條帶及預(yù)期的結(jié)合條帶。這個(gè)結(jié)果提示二者可能存在某種相互關(guān)系，結(jié)合FAT10表達(dá)與亞細(xì)胞定位結(jié)果，F(xiàn)AT10和PRAK可能在細(xì)胞周期的某一期發(fā)生作用，對(duì)于這一點(diǎn)需要進(jìn)一步探討。 同時(shí)我們對(duì)RFP-FAT10和GFP-PRAK共表達(dá)在細(xì)胞HEK293的定位進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)，在給予饑餓處理24h后再加入FBS 2h后，單表達(dá)RFP-FAT10的細(xì)胞核中出現(xiàn)粗大明亮的紅色熒光顆粒，而與GFP-PRAK共表達(dá)時(shí)胞核中的紅色顆粒消失，另外，在饑餓后24h再給予FBS 1h時(shí)間點(diǎn)，F(xiàn)AT10和PRAK在胞核內(nèi)有共定位。另外，饑餓后再給予FBS的2h時(shí)間點(diǎn)，單表達(dá)RFP-FAT10的HEK293細(xì)胞形成多形核，而共表達(dá)的細(xì)胞則無(wú)此現(xiàn)象發(fā)生。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道我們推測(cè)，F(xiàn)AT10過(guò)表達(dá)能夠引起細(xì)胞染色體不穩(wěn)定，出現(xiàn)多形核，而PRAK則能糾正這個(gè)過(guò)程。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)FAT10蛋白在饑餓狀態(tài)下促進(jìn)HEK293細(xì)胞凋亡，并且其表達(dá)定位可能與細(xì)胞周期有關(guān)。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明FAT10和PRAK存在特異性結(jié)合。共定位研究表明，F(xiàn)AT10和PRAK在細(xì)胞周期的某一期具有空間上的共定位。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，共表達(dá)FAT10和PRAK時(shí)，能被FAT10抗體識(shí)別的36 kD結(jié)合條帶消失。單轉(zhuǎn)染FAT10的細(xì)胞可能出現(xiàn)多形核，但是共轉(zhuǎn)染了PRAK能糾正這種現(xiàn)象。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示了PRAK在細(xì)胞周期調(diào)控中的新的功能，這對(duì)認(rèn)識(shí)PRAK和FAT10的特性和功能具有非常重要的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1377508