發(fā)布時(shí)間：2018-01-04 05:29

  本文關(guān)鍵詞：重組幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白融合疫苗的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的: 幽門螺桿菌(H.pylori)的全球感染率超過了50%,它是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的主要病因,與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)�，F(xiàn)有的根除H.pylori的手段主要是聯(lián)合應(yīng)用抗生素,但由于該菌感染的普遍性、耐藥菌株的不斷增加、較高的花費(fèi)以及病人的低依從性等,限制了抗菌藥物的療效。因此,接種簡便、成本低廉并易于大面積推廣的H.pylori疫苗的研究十分迫切。 中性粒細(xì)胞激活蛋白(HP-NAP)為新近發(fā)現(xiàn)的H.pylori主要毒力因子之一,幾乎所有的幽門螺桿菌菌株都有表達(dá)。H.pylori尿素酶具有分布于細(xì)菌外膜、高度保守、顆粒狀結(jié)構(gòu)、分子量大和強(qiáng)免疫原性等特點(diǎn),因此最早被作為H.pylori疫苗的侯選抗原。粘附于胃上皮細(xì)胞是H.pylori定植并致病的前提,阻斷H.pylori的粘附顯然可以防治H.pylori感染,所以,暴露于細(xì)菌表面并與H.pylori定植密切相關(guān)的粘附素HpaA是理想的候選抗原。粘膜免疫必須輔以合適的佐劑,大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)就具有很強(qiáng)的粘膜免疫佐劑效應(yīng)。 因此,本研究擬對(duì)上述三種保護(hù)性抗原基因進(jìn)行克隆表達(dá),并與分子內(nèi)佐劑LTB串聯(lián)得到多亞單位的融合蛋白,分別觀察在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的不同免疫應(yīng)答和保護(hù)作用,為篩選有效的H.pylori疫苗抗原奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、采用PCR方法從H.pylori SS1基因組中擴(kuò)增napA基因片段并構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-11c中,通過酶切、測(cè)序鑒定陽性重組子。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAssist和GenBank數(shù)據(jù)庫對(duì)已公布的H.pylori napA基因序列進(jìn)行相似性分析。將含目的基因片段的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),用AKTA-explore純化儀純化表達(dá)的重組蛋白rNAP。應(yīng)用Tris-Tricine方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物和純化產(chǎn)物進(jìn)行分析,用純化的rNAP免疫家兔,并采用Western blot和免疫擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定重組蛋白的免疫性。 2、采用重疊延伸PCR的方法,以NAP做為融合蛋白前端,與粘膜佐劑LTB或HpaA-UreB414-LTB融合基因依次串聯(lián),在片段間引入5個(gè)氨基酸的linker PQDPP進(jìn)行連接:將融合基因構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-22b(+)中,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后,陽性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)重組工程菌表達(dá)。Tris-Tricine電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白,DNAssist軟件分析融合蛋白理化特性,通過純化條件摸索,AKTA-explore純化儀純化融合蛋白NapA-LTB(NL)和NapA-HpaA-UreB414-LTB(NHUL)。純化后的融合蛋白分別與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn)。 3、將重組工程菌pET28a-hu1/BL21進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過包含體洗滌進(jìn)行初純化,Tris-Tricine電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白。 4、將110只小鼠隨機(jī)分為5組:PBS對(duì)照組、多亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(HpaA-UreB414-LTB、NapA-HpaA-UreB414-LTB)、單一亞單位分子內(nèi)佐劑融合蛋白組(NapA-LTB)、無分子內(nèi)佐劑單一亞單位蛋白組(NAP)。分別于0、7、14、28天口服免疫,劑量為150gg/只/次。末次免疫后10天,每組取10只小鼠剖殺取樣,ELISA檢測(cè)口服免疫后血清特異性IgG、IgA,胃、腸道粘液sIgA水平。每組余下12只口服攻毒10~8CFU H.pylori動(dòng)物適應(yīng)株,30天后,取小鼠胃部標(biāo)本通過H.pylori培養(yǎng)、快速尿素酶試驗(yàn)及特異性PCR檢測(cè),并計(jì)算口服免疫后各組攻毒保護(hù)率。 結(jié)果: 1、經(jīng)酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果顯示,H.pylori napA基因被正確克隆到pET-11c中。NapA基因的核苷酸序列長度為432bp,與GenBank中序列比較,同源性為95%-98%,氨基酸序列的同源性為100%。重組工程菌IPTG誘導(dǎo),經(jīng)Tris-Tricine分析,表達(dá)的目的蛋白分子量約為17KD,其表達(dá)產(chǎn)物占菌體蛋白的50%,為可溶形式表達(dá),經(jīng)AKTA-explore 100蛋白純化系統(tǒng)純化,純化后得劍純度＞90%的目的蛋白。以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫家兔,制備兔抗rNAP特異抗體,經(jīng)免疫雙擴(kuò)散法檢測(cè),兔抗血清抗體效價(jià)為1∶32,Western Blot結(jié)果也顯示重組蛋白能被兔抗H.pylori血清所識(shí)別。 2、經(jīng)酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了融合基因NapA-LTB和NapA-HpaA-UreB414-LTB,將融合基因NL和NHUL克隆到pET-22b(+)載體上,得到了重組融合蛋白表達(dá)載體。將兩個(gè)陽性重組子轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)后,37℃培養(yǎng)經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)的融合蛋白經(jīng)Tris-Tricine和免疫印跡分析顯示分子量約為29KD和59KD。UVP掃描證實(shí)融合蛋白表達(dá)約占總蛋白30%和25%。融合蛋白以包涵體和可溶兩種形式表達(dá),分別采用親和層析或離子交換層析的純化方法,純化后得到純度＞80%的融合蛋白。純化后的兩個(gè)融合蛋白分別能與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂發(fā)生結(jié)合反應(yīng),實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組融合蛋白中LTB組分具有與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的生物活性,說明融合蛋白保持了LTB的天然活性,具有粘膜佐劑活性。 3、重組工程菌pET28a-hu1/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)的融合蛋白經(jīng)Tris-Tricine和免疫印跡分析顯示分子量約為42KD。融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá),純化后得到純度＞80%的融合蛋白。 4、ELISA檢測(cè)融合蛋白rHUL和rNHUL免疫小鼠后血清特異性IgG、IgA,胃、腸道粘液sIgA水平與PBS、rNAP組相比,升高明顯,差異極顯著(p＜0.001),與rNL免疫組相比,差異顯著(p＜0.05)。免疫攻毒后,免疫保護(hù)率為:rNAP組16.7%,rNL組66.7%,rHUL組83.3%,rNHUL組90.9%。統(tǒng)計(jì)分析顯示,多亞單位融合蛋白組免疫保護(hù)率與PBS組相比,差異極顯著(p＜0.001),與rNAP組相比,差異顯著(p＜0.05),分子內(nèi)佐劑的三價(jià)融合蛋白組rNHUL保護(hù)率最高。 結(jié)論: 1、成功克隆了H.pylori napA基因,與GenBank已公布的H.pylori菌株基因序列具有高度同源性。純化的重組蛋白rNAP,具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性,可以作為H.pylori基因工程疫苗候選抗原。 2、成功構(gòu)建、表達(dá)融合蛋白rNL和rNHUL,純化后的融合蛋白具有良好的抗原性;與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重組蛋白中LTB組分具有能與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的生物活性。 3、誘導(dǎo)表達(dá)了融合蛋白rHUL,經(jīng)包涵體洗滌后,Western blot檢測(cè)其具有良好的抗原性。 4、小鼠體內(nèi)特異性抗體水平及免疫保護(hù)效果都證明了重組融合蛋白具有良好的安全性和免疫保護(hù)效果,為進(jìn)一步的疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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