本文關(guān)鍵詞：副粘病毒Tianjin株HN和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)幼鼠免疫效果的評(píng)價(jià)　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 副粘病毒Tianjin株 仙臺(tái)病毒 HN基因 F基因 副流感病毒1型 呼吸道感染 免疫應(yīng)答

【摘要】： 副流感病毒可引起一系列的呼吸道疾病,哮吼(Croup)是副流感病毒感染的典型癥狀,其中以副流感病毒1型(hPIV1)感染最為明顯,如果感染hPIV1的嬰幼兒不及時(shí)入院治療,患兒將出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道感染癥狀,甚至危及生命,同時(shí),嬰幼兒人群hPIV1患病率將明顯升高。不僅如此，，它又可以累及成人。仙臺(tái)病毒(Sendai Virus, SeV),也稱鼠源副流感病毒1型,是負(fù)單鏈RNA病毒,仙臺(tái)病毒可以引起多種嚙齒類動(dòng)物呼吸道疾病,甚至爆發(fā)致死性肺炎。仙臺(tái)病毒感染宿主細(xì)胞由2種包膜糖蛋白HN和F介導(dǎo),兩種糖蛋白是主要保護(hù)性抗原。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒(鼠源副流感病毒1型)減毒活疫苗能夠保護(hù)非洲綠猴免受人源副流感病毒1型的攻擊,為仙臺(tái)病毒抗原成分保護(hù)嬰幼兒免受副流感病毒1型感染提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),但hPIV1或SeV的F蛋白以及仙臺(tái)病毒兩種包膜糖蛋白HN和F的聯(lián)合免疫效果的研究,文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。8年前從爆發(fā)急性呼吸道疾病的普通棉耳狨猴群體中分離出一株高血凝效價(jià)的病毒株,初步確認(rèn)為仙臺(tái)病毒,并將其命名為仙臺(tái)病毒tianjin株,后更名為副粘病毒Tianjin株,近期研究提示Tianjin株為仙臺(tái)病毒新的基因型。因此,我們以此株病毒構(gòu)建HN基因和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒,單獨(dú)或聯(lián)合免疫幼鼠,觀察它們?cè)谟资篌w內(nèi)的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用,評(píng)價(jià)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒及其免疫方法的效果。 使用RT-PCR擴(kuò)增病毒HN基因的全部編碼區(qū),HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后,定向插入pcDNA3真核表達(dá)載體,構(gòu)建副粘病毒Tianjin株HN真核表達(dá)質(zhì)粒；以病毒cDNA為模板,PCR擴(kuò)增副粘病毒Tianjin株F基因的全部編碼區(qū),F基因片段與T載體連接,構(gòu)建過(guò)渡質(zhì)粒,EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切過(guò)渡質(zhì)粒后,酶切片段定向插入pcDNA3真核表達(dá)載體,構(gòu)建副粘病毒Tianjin株F真核表達(dá)質(zhì)粒。兩種真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定,證明構(gòu)建質(zhì)粒結(jié)構(gòu)正確。構(gòu)建成功的HN基因和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒為下一步的體外表達(dá)和動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 成功構(gòu)建的HN基因和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pcDNA.HN和pcDNA.F,質(zhì)粒經(jīng)去內(nèi)毒素處理后,借助陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞,進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),應(yīng)用RT-PCR、免疫熒光技術(shù)和ELISA方法檢測(cè)重組子在COS7細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯。RT-PCR結(jié)果提示pcDNA.HN和pcDNA.F可以在COS7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄；間接免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞可見(jiàn)較弱的黃綠色熒光物質(zhì),而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞未見(jiàn)有熒光物質(zhì)出現(xiàn)；原位ELISA和使用細(xì)胞裂解物作為抗原的ELISA檢測(cè)結(jié)果一致,并且均提示COS7細(xì)胞可以表達(dá)抗原蛋白。證明表達(dá)成功的HN基因和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒為動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 選取4-6周齡ICR幼鼠,肌內(nèi)注射布比卡因預(yù)處理24h后,純化的去內(nèi)毒素的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA.HN和pcDNA.F單獨(dú)或聯(lián)合經(jīng)肌內(nèi)途徑免疫幼鼠,動(dòng)態(tài)觀察幼鼠的免疫應(yīng)答水平；4周后經(jīng)鼻腔同株病毒攻擊小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn),觀察小鼠的存活情況、靶器官的變化和免疫應(yīng)答水平。以滅活的副粘病毒Tianjin株加Al(OH)3佐劑作為陽(yáng)性對(duì)照、空質(zhì)粒pcDNA3和生理鹽水作為陰性對(duì)照,通過(guò)小鼠存活率、脾臟和胸腺臟器比、肺組織病理變化、血凝抑制(HI)抗體、溶血抑制(HLI)抗體、B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖反應(yīng)、血清IgM和IgG抗體、細(xì)胞因子IFN-γ,IL-2和IL-4等指標(biāo)評(píng)價(jià)副粘病毒Tianjin株HN基因和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)和聯(lián)合使用的免疫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示副粘病毒Tianjin株HN基因和F基因真核表達(dá)質(zhì)�？梢院芎玫卣T發(fā)幼鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,能夠保護(hù)小鼠免受隨后同株病毒的攻擊；并且多項(xiàng)指標(biāo)(B細(xì)胞刺激指數(shù)、T細(xì)胞刺激指數(shù)、血清IgM和IgG水平)顯示副粘病毒Tianjin株HN基因真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫效果好于F基因真核表達(dá)質(zhì)粒,同時(shí)小鼠存活率、肺臟病理學(xué)變化、HI抗體、HLI抗體、B細(xì)胞刺激指數(shù)、T細(xì)胞刺激指數(shù),血清IgG水平、血清IFN-γ和IL-2水平等指標(biāo)均顯示聯(lián)合免疫效果好于單獨(dú)免疫效果。小鼠存活率、肺臟病理學(xué)變化、B細(xì)胞刺激指數(shù)、T細(xì)胞刺激指數(shù)、血清IgG抗體、血清IFN-γ和工L-2水平支持滅活病毒組幼鼠的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用好于真核表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)使用的免疫效果,而滅活病毒組與聯(lián)合質(zhì)粒組的免疫效果之間的比較仍需進(jìn)一步研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA.HN和pcDNA.F聯(lián)合免疫在預(yù)防幼鼠同株病毒呼吸道感染的效果明顯,為副粘病毒Tianjin株包膜HN和F蛋白預(yù)防嬰幼兒副流感病毒感染提供了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)。在現(xiàn)有的免疫方法不能有效預(yù)防嬰幼兒副流感病毒感染的情況下,副粘病毒Tianjin株主要保護(hù)性抗原HN和F的DNA免疫不失為一種備選方案。
[Abstract]:A series of respiratory diseases are caused by parainfluenza virus , which is a typical symptom of parainfluenza virus infection . In this case , the infection of human parainfluenza virus type 1 ( hPIV1 ) is the most obvious . RT - PCR was used to amplify the whole coding region of the HN gene of the virus , and then inserted into the eukaryotic expression vector of pcDNA3 eukaryotic expression vector . The eukaryotic expression plasmids of HN gene and F gene were respectively named pcDNA . HN and pcDNA . F . After endotoxin treatment , COS7 cells were transfected with cationic liposome . The results of RT - PCR showed that pcDNA , HN and pcDNA could be transcribed and translated in COS7 cells . The results of indirect immunofluorescence showed that pcDNA , HN and pcDNA could be transcribed in COS7 cells . The results showed that the eukaryotic expression plasmid of HN gene and F gene of parvivirus Tianjin strain could induce the humoral immunity and cellular immune response of mice . The results showed that the immune response and immune protective effect of the HN gene and the serum IgG antibody , the serum IgG level , the serum IFN - 緯 and the IL - 2 level in mice were better than that of the eukaryotic expression plasmid . The results showed that the immune response and immune protection of the mice were better than that of the eukaryotic expression plasmid . The results showed that the eukaryotic expression plasmid pcDNA . HN and pcDNA . F combined immunization in the prevention of the respiratory tract infection of the same strain of the young mouse had obvious effect , which provided the experimental animal basis for the prevention of the infection of the parainfluenza virus strain HN and F protein . In the present immunization method , the DNA immunization of the main protective antigens HN and F of the parvivirus Tianjin strain was not an alternative .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫明增;琦祖和;潘燕;;人apoE_7基因在NIH/3T3細(xì)胞中瞬時(shí)及穩(wěn)定表達(dá)[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1998年02期

2 許曉群;張建;張彩;游力;張建華;劉金生;王郡甫;高春義;田志剛;;NKG2D真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)YT細(xì)胞生物學(xué)功能的影響[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2005年12期

3 龍淼云;鄭啟昌;宋自芳;胡青鋼;張勇;田元;張景輝;;血管生成抑制因子arresten的真核表達(dá)體系的建立[J];腫瘤防治研究;2007年01期

4 遲春萍;隋紅;李雨桐;薛向光;王志武;牛靈;劉暢;王艷芳;吳曉娟;郭立君;盛軍;李校X;;人Cu,Zn-SOD基因在畢赤酵母中的表達(dá)及穩(wěn)定性[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2008年05期

5 彭國(guó)平;周承;吳煒;孫雯;田鋒;賀紀(jì)凱;陳智;;抗鼠CTLA-4單鏈抗體的構(gòu)建與表達(dá)及其免疫學(xué)活性的鑒定[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年03期

6 王丹;駱倩倩;朱俐;;人低氧誘導(dǎo)因子1α真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定[J];交通醫(yī)學(xué);2009年02期

7 楊小艷;楊勇;鄭勇;李睿;周婷;;外源Smad7轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞及對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年50期

8 黃麗麗;張百芳;葉鳳;伍婷婷;曹佳;李小明;;不同分子區(qū)域的Caveolin-1真核表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)Caveolin-1基因敲除小鼠系膜細(xì)胞周期的影響[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

9 張建國(guó),步星耀,周偉,朱賢立;人促血管生成素-2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序分析[J];山東醫(yī)藥;2005年30期

10 王鷹;郝飛;楊希川;鄧軍;;SV40TAg真核表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建[J];免疫學(xué)雜志;2006年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 貝為成;何啟蓋;金梅林;陳煥春;;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素apxⅡA基因的真核表達(dá)及其核酸疫苗研究[A];湖北省生物工程學(xué)會(huì)2004年年會(huì)學(xué)術(shù)報(bào)告及論文摘要匯編[C];2004年

2 于運(yùn)峰;李士澤;楊煥民;紀(jì)麗麗;;Leptin的原核表達(dá)蛋白及真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)小白鼠繁殖性能的影響[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第九次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2006年

3 劉平;林英;鄭建秋;葛紅巖;金迪;馬洪梅;付曉玻;;P88Q突變型GJA8基因致白內(nèi)障機(jī)制初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

4 陳建忠;朱海紅;陳智;劉克洲;;小鼠TLR3真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其活性初步鑒定[A];浙江省免疫學(xué)會(huì)第五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2004年

5 唐熠;謝芝勛;劉加波;龐耀珊;鄧顯文;謝志勤;謝麗基;;hexon-Linker-ChIL2融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其體外表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

6 李暉;任小華;鐘森;任紅;;結(jié)核分支桿菌含信號(hào)肽的mtb8.4基因的克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[A];中國(guó)防癆雜志2003第25卷增刊——2003年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2003年

7 王曉東;林鐲;張友才;陳永平;許爛漫;陳國(guó)榮;鞏躍文;;大鼠肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與肝再生增強(qiáng)因子融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[A];2009香港-北京-杭州內(nèi)科論壇暨2009年浙江省內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

8 王佑民;傅祖植;;全長(zhǎng)SD大鼠長(zhǎng)胞內(nèi)段瘦素受體(OBRa)cDNA的克隆及其真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

9 林綺萍;吳少庭;翁亞彪;袁仕善;高世同;秦莉;雷明軍;潘暉榕;張仁利;黃達(dá)娜;溫見(jiàn)翔;;SARS病毒N蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答[A];全國(guó)新出現(xiàn)傳染病學(xué)術(shù)研討會(huì)資料匯編[C];2004年

10 李丹莉;張昌菊;柳長(zhǎng)柏;;pIRES-CRT/E2-SLC真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[A];第十屆全國(guó)生化與分子藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 記者 張亞男;在津全國(guó)人大代表專題調(diào)研泰達(dá)就業(yè) Tianjin’s NPC Representatives Inspect TEDA[N];北方經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2009年

2 馮世容;肝移植排斥反應(yīng)有望攻克[N];廣東科技報(bào);2000年

3 馮世容;肝移植排斥反應(yīng)研究獲突破[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2000年

4 ;我國(guó)戊型肝炎的特點(diǎn)及防治[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

5 本報(bào)記者 張小雷;中國(guó)“血統(tǒng)”電動(dòng)車美國(guó)爭(zhēng)市場(chǎng)[N];中國(guó)商報(bào);2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張國(guó)際;副粘病毒Tianjin株HN和F基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)幼鼠免疫效果的評(píng)價(jià)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2007年

2 郭春霞;商陸抗病毒蛋白抑制HBV復(fù)制的研究[D];華中科技大學(xué);2008年

3 錢(qián)冠華;NIRF蛋白對(duì)HBV核心蛋白的作用及其機(jī)制的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

4 姜海龍;狂犬病病毒糖/核融合基因DNA疫苗的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 賈怡;一種新型重組免疫毒素DT390-Rantes治療小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的研究[D];四川大學(xué);2006年

6 戚卉;Peroxiredoxin 6在糖尿病視網(wǎng)膜病變中抗氧化損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2009年

7 張守純;p16真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

8 余興龍;提高豬瘟DNA疫苗免疫保護(hù)的探索研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2000年

9 蘇鳳艷;水貂CDV的分離鑒定及其主要基因的克隆與免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 楊誠(chéng);自噬基因Beclin 1與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 譚潔瓊;SARS-CoV S1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)和純化[D];南華大學(xué);2005年

2 孫裴;豬瘟病毒P80基因的真核表達(dá)及p80蛋白對(duì)PK-15細(xì)胞致病變作用的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2005年

3 康春雨;人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2真核表達(dá)質(zhì)粒的制備、轉(zhuǎn)染及表達(dá)[D];東南大學(xué);2005年

4 王耀晟;表達(dá)hVEGF_（121）/EGFP的間充質(zhì)干細(xì)胞制備及缺氧對(duì)其表達(dá)影響[D];南昌大學(xué);2007年

5 鄢敏;水皰性口炎病毒M蛋白體外誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的研究[D];吉林大學(xué);2006年

6 唐文琴;人生長(zhǎng)激素受體的定點(diǎn)突變及其真核表達(dá)[D];江西師范大學(xué);2007年

7 馬愛(ài)霞;鵝源副粘病毒NA-1株糖蛋白基因在原核及真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)[D];吉林大學(xué);2008年

8 于欽磊;隱孢子蟲(chóng)CP12/CP21雙價(jià)核酸疫苗的研究[D];吉林大學(xué);2008年

9 胡艷;髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[D];浙江大學(xué);2011年

10 徐大琴;人KCNJ15基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其體外功能研究[D];華中科技大學(xué);2011年

本文編號(hào)：1376665