本文關(guān)鍵詞：瘧疾傳播阻斷疫苗免疫效應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《中國醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 以昆蟲蚊為傳播媒介的瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的原蟲感染性疾病。WHO的報(bào)告顯示，全世界近1／3的人口生活在瘧疾風(fēng)險(xiǎn)區(qū)，每年約200萬人因其死亡。雖然抗瘧治療對(duì)降低瘧疾的死亡率和抑制其傳播取得了顯著成效，但由于耐藥性蟲株和抗殺蟲劑性蚊株的普遍出現(xiàn)，單純的抗瘧治療已不能有效地遏制瘧疾的流行。因此，開發(fā)有效的瘧疾疫苗是當(dāng)今瘧疾防治亟待解決的課題。 瘧疾疫苗主要包括抗感染疫苗、抗發(fā)病疫苗和傳播阻斷疫苗。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在致力于瘧疾感染阻斷疫苗和發(fā)病阻斷疫苗研發(fā)的同時(shí)，也愈發(fā)關(guān)注的傳播阻斷疫苗研制。傳播阻斷疫苗，是以蚊階段原蟲特異表達(dá)的表面蛋白作為抗原免疫宿主，其產(chǎn)生的抗體可同蚊胃內(nèi)原蟲發(fā)育時(shí)表達(dá)的表面蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，并以此抑制原蟲在蚊體內(nèi)的進(jìn)一步發(fā)育，從而阻斷瘧疾的傳播。與其他兩類疫苗相比，其優(yōu)點(diǎn)為靶蟲體—配子體數(shù)目明顯少于紅內(nèi)期原蟲數(shù)目；作為疫苗開發(fā)研究障礙的抗原變異較為少見；通過與藥物或其它瘧疾疫苗的聯(lián)合應(yīng)用可防止耐藥性原蟲的擴(kuò)散。由于傳播阻斷疫苗候選抗原僅表達(dá)于蚊階段蟲體，人體免疫壓力不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，故抗原變異少見；由于該候選疫苗在宿主體內(nèi)基本不表達(dá)，人體自然感染不能產(chǎn)生傳播阻斷抗體，所以研制開發(fā)并應(yīng)用接種于宿主意義重大。而更重要的是，從群體角度出發(fā)，個(gè)體接種疫苗后，受益的將是整個(gè)流行區(qū)內(nèi)的人群。 數(shù)種瘧原蟲的克隆結(jié)果顯示，傳播阻斷蛋白可被分成2個(gè)亞家族，即P25和P21／P28。有文獻(xiàn)報(bào)道：Pbs21(P．berghei)在配子體發(fā)生后2h即有表達(dá)，并在合子和動(dòng)合子表面持續(xù)存在；Pbs21基因敲出后，其動(dòng)合子向囊合子的發(fā)育明顯受阻。蚊吸血或體外培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，抗Pfs28(P．falciparum)、抗Pgs28(P．gallinaceum)、抗Pys21(P．yoelii)和抗Pbs21的單克隆抗體或免疫血清均具有明顯傳播阻斷效應(yīng)，其作用機(jī)制可能是IgG阻斷動(dòng)合子對(duì)蚊胃上皮細(xì)胞的侵入。Pbs21可同蚊胃粘膜的層粘連蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，使用抗Pbs21抗體封閉Pbs21后，即能抑制動(dòng)合子對(duì)蚊胃基底膜上粘連蛋白的結(jié)合，進(jìn)而阻斷囊合子的形成。因此，抗體與P25和P21／28發(fā)生特異性結(jié)合進(jìn)而妨礙抗原的功能可能是傳播阻斷抗體的主要作用機(jī)制。酵母菌表達(dá)的Pvs25以及Pvs28可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體且具有理想的傳播阻斷效應(yīng)已被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，但就其免疫原性的系統(tǒng)研究目前尚未見報(bào)道，而疫苗效應(yīng)的原理恰恰在于它可在接種疫苗的個(gè)體中誘生抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞。 確定疫苗的免疫原性是評(píng)價(jià)疫苗的有效性的前提。真核細(xì)胞表達(dá)的傳播阻斷候選蛋白在空間構(gòu)象上與其天然結(jié)構(gòu)基本相似，其誘導(dǎo)的傳播阻斷效應(yīng)也明顯優(yōu)于原核細(xì)胞表達(dá)的蛋白分子。間日瘧原蟲(P．vivax)是我國流行最為嚴(yán)重的蟲種，為此，我們以酵母菌(S．cerevisiae)表達(dá)的傳播阻斷疫苗候選蛋白Pvs25和Pvs28免疫小鼠，并對(duì)小鼠免疫后的應(yīng)答特點(diǎn)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，以期明確該疫苗的免疫活性。由于嚙齒類瘧原蟲與人類瘧原蟲具有相似的生物學(xué)性狀，所以我們同時(shí)也用該酵母菌表達(dá)的約氏瘧原蟲(P．yoelii)動(dòng)合子表面蛋白Pys25對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，通過對(duì)其免疫活性、免疫機(jī)制以及免疫血清傳播阻斷效應(yīng)的觀察，進(jìn)一步證明了傳播阻斷疫苗的效應(yīng)分子和作用機(jī)制。 方法 一、采用ELISA法檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫前后DBA／2小鼠血清中特異性IgG的水平 尾尖采集初次免疫前和免疫后不同時(shí)間小鼠血液，分離血清。分別以溶于碳酸鹽緩沖液的Pvs25重組蛋白(200ng／孔)，Pvs28重組蛋白(100ng／孔)包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜；用含1％BSA的PBS封閉1h，以7BS緩沖液1∶200倍稀釋免疫后不同時(shí)間的小鼠血清，每孔加100μl，室溫孵育2h，加1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶標(biāo)儀檢測490nm處OD值。 二、采用ELISA法檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特異性IgG亞類的水平 將1∶200倍稀釋后不同時(shí)間段的特異性血清加入預(yù)包被好的96孔培養(yǎng)板中，100μl／孔，室溫孵育2h，分別加入濃度為500ng／ml、250ng／ml生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG1及IgG2a檢測抗體，100μl／孔，37℃孵育1h；加入親和素37℃孵育1h，加底物，避光30min后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測450nm處OD值。 三、采用雙抗體夾心ELISA法檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子 分別于免疫前及初次免疫后第14d、28d、42d、56d、70d、84d、98d和112d，常規(guī)無菌取小鼠的脾臟，制備濃度為1×10~7／ml脾細(xì)胞懸液，于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)上清，用雙抗體夾心ELISA試劑盒(RD公司)分別檢測IFN-γ、IL-4和IL-10產(chǎn)生水平。酶標(biāo)儀測定450nm處的OD值。應(yīng)用SoftMax Pro 4．3．1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg／ml)。 四、ELISPOT檢測Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠后脾臟IFN-γ~+和IL-4~+細(xì)胞數(shù)量 分別于初次免疫后70d和98d，無菌取小鼠的脾臟，，分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基制備脾淋巴細(xì)胞懸液，采用ELISPOT試劑盒對(duì)小鼠脾臟IFN-γ~+和IL-4~+細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測。主要步驟如下：以IFN-γ以及IL-4包被抗體各50μl分別包被70％乙醇予濕后的96孔PVDF膜平板，4℃過夜；加入封閉液37℃封閉1h后，每孔加入脾細(xì)胞4×10~5個(gè)，并分別加入Pvs28或Pvs25重組蛋白，置5％C02的培養(yǎng)箱中共同孵育24h后棄去細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的IFN-γ或IL-4檢測抗體，37℃孵育1h，加入親和素，37℃孵育1h，顯色液100μl／孔，顯色30min，待顯示斑點(diǎn)后，用去離子水洗板終止反應(yīng)，ELISPOT自動(dòng)分析儀讀板，計(jì)數(shù)IFN-γ~+和IL-4~+L細(xì)胞SFC數(shù)量(斑點(diǎn)形成數(shù)／百萬個(gè)細(xì)胞)。 五、采用ELISA法檢測Pys25重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特異性IgG的水平 尾尖采集初次免疫前和免疫后不同時(shí)間小鼠血液，分離血清。以溶于碳酸鹽緩沖液的Pys25重組蛋白200ng／孔包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃過夜；用含1％BSA的PBS封閉1h，以TBS緩沖液1∶200倍稀釋免疫后不同時(shí)間的小鼠血清，每孔加100μl，室溫孵育2h，加1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育1h，加底物溶液。酶標(biāo)儀測490nm處OD值。 六、采用雙抗體夾心ELISA法檢測Pys25重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子 無菌取出于免疫前、初次免疫后第2W和加強(qiáng)免疫后第2W的小鼠脾臟，用含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)脾細(xì)胞終濃度至1×10~7／ml。于24孔培養(yǎng)板上加入脾細(xì)胞懸液，500μl／孔，培養(yǎng)48h，收集上清。用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測IFN-γ和IL-4產(chǎn)生水平。酶標(biāo)儀測其450nm處OD值，并以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清中IFN-γ和IL-4含量。 七、ELISPOT檢測Pys25重組蛋白免疫DBA／2小鼠后脾臟IFN-γ~+和IL-4~+細(xì)胞數(shù)量 用淋巴細(xì)胞分離液分離加強(qiáng)免疫后第2W小鼠脾淋巴細(xì)胞，以培養(yǎng)液調(diào)淋巴細(xì)胞終濃度至4×10~6／ml。用IFN-γ以及IL-4包被抗體分別包被96孔PVDF膜板，4℃過夜。以含BSA的PBS封閉1h，加淋巴細(xì)胞，4×10~5個(gè)／孔，每個(gè)樣本設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37℃孵育24h。加生物素標(biāo)記的IFN-γ或IL-4檢測抗體，孵育1h，加親和素后再孵育1h。加顯色液顯色30min。ELISPOT自動(dòng)分析儀讀板，計(jì)數(shù)IFN-γ~+和IL-4~+細(xì)胞數(shù)量 八、動(dòng)合子培養(yǎng)和傳播阻斷效應(yīng)觀察 心臟采集P．yoelii17XL(1x10~+ PRBC)感染的第3d小鼠血液(肝素抗凝)，分裝于1.5ml離心管中，200μl／管，離心，去上清。加入含不同濃度免疫血清的動(dòng)合子培養(yǎng)液，200μl／管。24℃培養(yǎng)工6h后，取3μl懸液滴于熒光載片上，冷丙酮固定。用含5％脫脂奶粉的PBS 37℃封閉30min。加酶標(biāo)羊抗鼠IgG，孵育30min，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)合子和動(dòng)合子的形成數(shù)量。同時(shí)設(shè)單純佐劑免疫的小鼠血清為對(duì)照。 結(jié)果 一、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特異性IgG的水平的變化 于初次免疫后第28d，重組蛋白免疫組的IgG水平開始上升。至初次免疫后第112d仍維持于高水平，與免疫前以及佐劑對(duì)照組相比差異顯著；而對(duì)照組的抗體水平在免疫前后則無明顯變化。 二、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特異性IgG亞類水平的變化 重組蛋白組在初次免疫后第28d，小鼠血清中特異性IgG1以及IgG2a均出現(xiàn)有意義的升高，此后IgG1持續(xù)維持在一個(gè)較高的水平，至初次免疫后第112d仍無下降的趨勢；而IgG2a則于初次免疫后第42d出現(xiàn)下降，且此后進(jìn)一步下降；而對(duì)照組的抗體亞類水平在免疫前后則無明顯變化。 三、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的變化 1、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IPN-γ水平 于初次免疫后第14d，小鼠的IFN-γ水平與免疫前相比顯著升高，但此后明顯下降，并于第42d降至免疫前的水平。在第14d佐劑注射組IFN-γ水平也較免疫前出現(xiàn)了一定的升高，但其升高水平顯著低于重組蛋白免疫組。 2、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4和IL-10水平 于初次免疫后第28d，重組蛋白免疫組IL-4水平均出現(xiàn)有意義的升高，于第56d達(dá)到峰值水平后開始下降，但在112d仍高于免疫前水平。IL-10水平亦于初次免疫后第28d出現(xiàn)有意義的升高，于第42d達(dá)到高峰后出現(xiàn)下降，但在112d也仍高于免疫前水平。佐劑組的IL-4、IL-10水平較免疫前無顯著變化。 四、ELISPOT檢測Pvs25，Pvs28重組蛋白免疫DBA／2小鼠后脾臟IFN-γ~+和IL-4~+細(xì)胞數(shù)量 疫苗免疫組小鼠的IFN-γ~+細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組無明顯差異。而IL-4~+細(xì)胞數(shù)量卻顯著增加，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IFN-γ~+以及IL-4~+細(xì)胞數(shù)分別與各自組比較無明顯差異。佐劑組的IL-4~+水平較免疫前無顯著變化。 五、Pys25重組蛋白免疫DBA／2小鼠前后血清中特異性IgG的水平變化 初次免疫后2W，小鼠血清中IgG出現(xiàn)升高，并于加強(qiáng)免疫后2～3W達(dá)到峰值水平。此后開始緩慢下降，但其在20w的水平也明顯高于加強(qiáng)免疫前的水平。 六、Pys25重組蛋白免疫DBA／2小鼠后不同時(shí)間檢測點(diǎn)上的細(xì)胞因子水平 與免疫前相比，初次免疫后2W，小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4均出現(xiàn)了有意義的升高，但前者的升高水平更為顯著；再次免疫后僅見IL-4出現(xiàn)了進(jìn)一步的升高，而IFN-γ已降至初次免疫前的水平。 七、Pys25重組蛋白加強(qiáng)免疫DBA／2小鼠后脾細(xì)胞中IFN-γ~+和IL-4~+細(xì)胞數(shù)量 與免疫前相比，加強(qiáng)免疫后2W，小鼠脾細(xì)胞中IL-4~+細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)了顯著的升高，但I(xiàn)FN-γ~+細(xì)胞的數(shù)量未出現(xiàn)有意義的變化。 八、動(dòng)合子培養(yǎng)和傳播阻斷效應(yīng) 與對(duì)照組相比，Pys25重組蛋白加強(qiáng)免疫后2w的抗血清對(duì)合子和動(dòng)合子的形成具有明顯的抑制效應(yīng)，該效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，其中4倍稀釋的抗血清幾乎完全阻斷了蟲體的發(fā)育。并且，免疫20W的抗血清對(duì)蟲體的發(fā)育也仍具有明顯的抑制效應(yīng)。 結(jié)論 1、Pvs25、Pvs28重組蛋白具有較好的免疫活性，免疫DBA／2小鼠后可產(chǎn)生高水平的抗體； 2、Pvs25、Pvs28免疫DBAl2小鼠后產(chǎn)生以的抗體亞類以IgG1為主； 3、Pvs25、Pvs28重組蛋白可誘導(dǎo)DBA／2小鼠產(chǎn)生以Th2反應(yīng)為主的免疫應(yīng)答； 4、Pvs25、Pvs28重組蛋白免疫DBA／2后可誘導(dǎo)較強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答，并具有顯著的免疫記憶性； 5、Pys25重組蛋白免疫DBA／2小鼠后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型以Th2反應(yīng)為主； 6、Pys25重組蛋白具有良好的免疫原性，其免疫血清可顯著抑制有性階段原蟲的進(jìn)一步發(fā)育。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭麗,徐衛(wèi)民,劉英杰,楊毅梅,曹雅明;間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25中國分離株高度保守[J];中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志;2004年01期

2 劉英杰,曹雅明,閆建忠;約氏瘧原蟲Pys25、Pys21抗原的表達(dá)及其傳播阻斷免疫的研究[J];中國免疫學(xué)雜志;2002年02期

3 劉軍,馮輝,鄭麗,楊毅梅,金行一,曹雅明;我國云南分離株間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗候選抗原pvs25基因多態(tài)性分析[J];中國人獸共患病雜志;2005年06期

本文編號(hào)：1374323