本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌HSP65與hIL-2融合基因的DNA疫苗和重組分枝桿菌疫苗的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 結(jié)核病(Tuberculosis ,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。近年來(lái),由于卡介苗(BCG)保護(hù)效果不佳,耐藥MTB菌株的出現(xiàn),艾滋病的流行以及人口流動(dòng)的增加等使得TB又卷土重來(lái),成為危害人類健康的傳染病的第一殺手。BCG是目前預(yù)防TB的唯一疫苗,但其不能有效預(yù)防成人TB,因此研究更為有效的TB新型疫苗對(duì)TB的防治有著重要的意義。 MTB熱休克蛋白65(HSP65)是MTB感染過(guò)程中的重要免疫保護(hù)性抗原之一。研究表明,用編碼該蛋白的重組質(zhì)粒免疫小鼠,可以明顯減少感染小鼠的脾肺荷菌數(shù);用編碼該蛋白的重組質(zhì)粒肌肉注射化療后的感染小鼠,可以有效清除小鼠體內(nèi)的持留菌。細(xì)胞因子IL-2是一種很好的免疫佐劑,其不僅可增加機(jī)體的免疫應(yīng)答,而且可以介導(dǎo)免疫反應(yīng)向Th1型方向發(fā)展,而該型的免疫反應(yīng)對(duì)控制MTB感染起著關(guān)鍵作用。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?構(gòu)建可表達(dá)HSP65-IL-2融合蛋白的DNA疫苗以及重組恥垢分枝桿菌(rM.S)疫苗,并與BCG相比較,評(píng)價(jià)這兩種疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫學(xué)特性和抵抗MTB感染的保護(hù)力,以期尋找有效的預(yù)防和治療TB的新型疫苗。 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果: 1. HSP65-IL-2融合蛋白的表達(dá)及純化 采用PCR方法從MTB H37Rv株DNA基因組中分兩段擴(kuò)增HSP65基因,并先后與pMD18-T載體連接,得到完整的全長(zhǎng)基因,經(jīng)測(cè)序證實(shí)與Genebank公布的MTB HSP65基因序列完全一致。利用PCR方法從含有hIL-2基因的pGEM-Teasy-IL-2質(zhì)粒中擴(kuò)增IL-2基因,利用引物設(shè)計(jì)在IL-2基因的上游引入一段48bp的疏水性linker。測(cè)序證實(shí)成功地在IL-2基因上游引入序列正確的linker,且IL-2基因序列也完全正確。將HSP65和IL-2基因按照相應(yīng)的酶切位點(diǎn)克隆入pMD18-T載體,得到HSP65-IL-2融合基因,并將其亞克隆入pPRO EX HTa原核表達(dá)載體,酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pPRO-hsp65-IL-2,并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明成功地表達(dá)了HSP65-IL-2融合蛋白;用抗人的IL-2 mAb進(jìn)行Western-blot證實(shí),其大小為78kD,與預(yù)計(jì)的蛋白大小相符。用Ni-NTA親和色譜柱純化獲得了目的蛋白。 2. HSP65-IL-2融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá) 利用酶切位點(diǎn)將HSP65-IL-2融合基因從pPRO-hsp65-IL-2中亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-),酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pcDNA-hsp65-IL-2。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P815細(xì)胞。間接免疫熒光檢測(cè)表明,HSP65-IL-2融合基因的真核表達(dá)載體可在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)成功地表達(dá)目的蛋白,且其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的P815細(xì)胞在G418壓力篩選下獲得了可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的P815細(xì)胞系。 3. HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗刺激小鼠的免疫應(yīng)答 將HSP65-IL-2融合基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒DNA(1μg/μl)肌肉注射免疫小鼠,每次100μl/只,間隔2周免疫一次,共免疫3次,同時(shí)設(shè)BCG和生理鹽水對(duì)照組。第三次免疫后4周,測(cè)定小鼠體內(nèi)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的平均抗體滴度為1:16,000,明顯高于BCG免疫組的1:4,000,且抗體亞類以Th1型的IgG2a為主(P0.01)。在細(xì)胞免疫應(yīng)答中,DNA疫苗組小鼠的脾淋巴細(xì)胞特異性增殖明顯,指數(shù)為2.2,顯著高于BCG組的增殖指數(shù)1.9(P0.05);DNA疫苗組的IFN-γ和IL-2水平分別為170.62±8.53pg/ml和37.59±1.88pg/ml ,明顯高于BCG組的120.24±6.01pg/ml和34.25±1.71pg/ml(IFN-γ,P0.01;IL-2,P0.05);DNA疫苗可使CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞明顯增殖,所占百分比分別為22.8%和11.2%,但仍低于BCG免疫小鼠的37.3%和12.8%(P0.05)。以穩(wěn)定表達(dá)HSP65-IL-2融合蛋白的P815轉(zhuǎn)染細(xì)胞為靶細(xì)胞,檢測(cè)DNA疫苗和BCG免疫小鼠后產(chǎn)生的CTL效應(yīng)。結(jié)果DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL殺傷活性當(dāng)效靶比為100:1時(shí)達(dá)93.5±4.7%,明顯高于BCG誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL殺傷活性46.7±2.2%(P0.01)。 4. HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗對(duì)MTB感染小鼠的預(yù)防保護(hù)效果 小鼠免疫完成后,用0.2mg/100μl的MTB H37Rv毒株尾靜脈感染,6周后,無(wú)菌分離小鼠的脾肺,計(jì)數(shù)脾肺組織的細(xì)菌荷菌數(shù),以log10CFU表示。結(jié)果表明,生理鹽水對(duì)照組小鼠的脾肺荷菌數(shù)分別為5.90±0.30log10和5.78±0.29log10,DNA疫苗組小鼠的脾肺荷菌數(shù)分別為4.56±0.23log10和4.34±0.22log10,其減少的差值分別為1.34log10和1.44log1(0P0.01),提示DNA疫苗對(duì)MTB感染小鼠有明顯的保護(hù)作用;但保護(hù)作用尚不如BCG(P0.05),后者免疫小鼠的脾肺荷菌數(shù)分別為4.20±0.21log10和3.90±0.19log10,減少的差值分別為1.70log10和1.88log10(P0.01)。 5. HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗對(duì)MTB感染小鼠的治療效果 每只小鼠經(jīng)0.2mg/100μl MTB H37Rv毒株尾靜脈感染4周后,再給小鼠肌肉注射重組質(zhì)粒DNA(1μg/μl),每次100μl/只,間隔2周注射一次,共注射3次,同時(shí)設(shè)BCG和生理鹽水對(duì)照組。末次注射后6周,無(wú)菌分離小鼠的脾肺,計(jì)數(shù)脾肺荷菌數(shù),以log10CFU表示。結(jié)果表明,MTB感染小鼠再注射生理鹽水對(duì)照組的脾肺荷菌數(shù)分別為6.50±0.33log10和6.38±0.32log10,而注射質(zhì)粒DNA組小鼠的脾肺荷菌數(shù)分別為6.24±0.31log10和6.00±0.30log10,分別減少了0.26log10和0.38log10(P0.05),提示質(zhì)粒DNA對(duì)MTB感染小鼠有一定的治療作用,但這種作用弱于注射BCG的對(duì)照組,后者的脾肺荷菌數(shù)分別為5.90±0.30log10和5.86±0.29log10,減少的差值分別為0.60log10和0.52log10(P0.01)。 6.分泌表達(dá)HSP65-IL-2融合蛋白的rM.S疫苗的構(gòu)建和表達(dá) 將HSP65-IL-2融合基因亞克隆入大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭分泌表達(dá)載體,構(gòu)建可分泌表達(dá)HSP65-IL-2融合蛋白的重組質(zhì)粒pDE22-hsp65-IL-2,并酶切鑒定。將重組質(zhì)粒電穿導(dǎo)入M.S感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)潮霉素抗性篩選rM.S陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性rM.S經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增目的基因片段,證實(shí)rM.S中含有目的基因。將rM.S擴(kuò)大培養(yǎng),收集培養(yǎng)上清,用HSP65-IL-2融合基因DNA疫苗免疫小鼠的抗血清進(jìn)行Western-blot分析,結(jié)果證實(shí)有特異性反應(yīng)的蛋白條帶,其大小與預(yù)期分子量一致;用該血清對(duì)rM.S進(jìn)行間接免疫熒光鑒定,也發(fā)現(xiàn)有特異性反應(yīng)的綠色熒光,表明rM.S中含有目的蛋白并能分泌表達(dá)。 7. rM.S疫苗刺激小鼠的免疫應(yīng)答 每只小鼠皮下免疫0.2mg/100μl的rM.S或BCG,在免疫后1周和4周時(shí),檢測(cè)這兩種疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果表明,rM.S免疫小鼠1周后就可產(chǎn)生較高的抗體水平,滴度為1:4,000,明顯高于BCG組的1:200(P0.01),而且抗體亞類以Th1型的IgG2a為主;rM.S免疫4周后,小鼠體內(nèi)的抗體水平下降,且抗體亞類轉(zhuǎn)為以Th2型的IgG1為主;用BCG對(duì)小鼠進(jìn)行同樣的免疫和觀察,其抗體水平一直很低,處于IgG1/ IgG2a相對(duì)平衡狀態(tài)。細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)rM.S在免疫小鼠1周后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)于其免疫4周后產(chǎn)生的。在免疫1周后,rM.S誘導(dǎo)的特異性脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為6.21,明顯高于同期BCG免疫組的3.33和生理鹽水對(duì)照組的1.01(P0.01);其誘生的IFN-γ和IL-2的水平分別為115.00±4.11 pg/ml和27.41±3.67pg/ml,明顯高于生理鹽水組的57.42±2.87pg/ml和9.53±1.32pg/ml(P0.01),而且IFN-γ水平也高于同期BCG免疫組的99.37±8.87pg/ml(P0.05),但I(xiàn)L-2的水平與BCG免疫組的31.21±2.87pg/ml相當(dāng)(P0.05);其刺激的脾淋巴細(xì)胞CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)值分別為50.4%和14.7%,均明顯高于生理鹽水對(duì)照組的20.5%和8.7%(P0.01),且其CD4~+T細(xì)胞數(shù)量明顯多于BCG免疫組的43.2%(P0.05),而CD8~+T細(xì)胞數(shù)與BCG免疫組的14.2%相當(dāng)(P0.05);其刺激的CTL殺傷活性當(dāng)效靶比為100:1時(shí)達(dá)84.2±4.2%,明顯高于BCG免疫組的38.9±1.9%和生理鹽水組的22.3±2.1%(P0.01)。 免疫4周后,rM.S誘導(dǎo)的特異性脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為1.91,與此時(shí)BCG免疫組的2.01相當(dāng)(P0.05),但仍高于生理鹽水組的1.15(P0.05),rM.S免疫組和BCG免疫組小鼠的特異性脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)均比其免疫1周后的指數(shù)低(P0.05);rM.S免疫組的IFN-γ和IL-2的水平下降到82.84±3.36pg/ml和16.62±2.02pg/ml,低于其免疫1周時(shí)的水平(P0.05),也低于此時(shí)BCG免疫組的水平117.60±7.91pg/ml和30.50±4.63pg/ml (P0.05),但仍高于生理鹽水組的59.03±2.95pg/ml和10.20±1.51pg/ml(P0.05);rM.S免疫組的CD4~+T細(xì)胞百分比27.0%,仍高于BCG免疫組的24.2%和生理鹽水組的20.5%(P0.05),但CD8~+T細(xì)胞百分比6.8%低于生理鹽水組的8.7%(P0.05),與BCG免疫組的4.8%相當(dāng)(P0.05),此時(shí)rM.S免疫組的CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞的總和仍高于生理鹽水組(P0.05),而B(niǎo)CG免疫組的CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞的總和與生理鹽水組相比沒(méi)有顯著性差異(P0.05),rM.S和BCG免疫組的CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞的百分比及其總和明顯低于它們免疫1周時(shí)刺激產(chǎn)生的CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞的百分比及其總和(P0.05);rM.S免疫組的脾淋巴細(xì)胞CTL活性當(dāng)效靶比為100:1時(shí)達(dá)62.3±3.1%,仍明顯高于BCG免疫組的47.5±2.3%和生理鹽水組的25.4±1.3%(P0.05),但低于其免疫1周時(shí)的活性(P0.05),而B(niǎo)CG免疫組的則高于其免疫1周時(shí)的活性(P0.05)。 8. rM.S疫苗對(duì)MTB感染小鼠的預(yù)防保護(hù)效果 rM.S和BCG免疫完成4周后,每只小鼠用0.2mg/100μl的MTB H37Rv毒株尾靜脈感染,6周后,無(wú)菌分離脾肺組織,計(jì)數(shù)脾肺荷菌數(shù),以log10CFU表示。結(jié)果表明,rM.S免疫小鼠的脾肺荷菌數(shù)分別為5.26±0.10log10和5.78±0.34log10,而生理鹽水組的為6.08±0.15log10和6.33±0.21log10,rM.S免疫小鼠的脾肺荷菌數(shù)減少的差值分別為0.82log10和0.55log10(P0.01),表明rM.S可有效保護(hù)小鼠抵抗MTB感染;BCG免疫小鼠的脾肺荷菌數(shù)分別為4.90±0.24log10和5.38±0.19log10,其與生理鹽水組相比減少的差值大于rM.S免疫小鼠與生理鹽水組小鼠的差值(P0.05)。 9.結(jié)論 可表達(dá)HSP65-IL-2融合蛋白的DNA疫苗和其rM.S疫苗均可在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答;而且rM.S疫苗可在免疫接種1周就達(dá)到免疫應(yīng)答的頂峰,其反應(yīng)強(qiáng)度超過(guò)了BCG誘導(dǎo)產(chǎn)生的,但這種免疫反應(yīng)消退也較快。DNA疫苗和rM.S疫苗都可顯著減少感染小鼠體內(nèi)的脾肺荷菌數(shù),表明其可抵抗MTB的感染,但這種保護(hù)作用尚不如BCG。今后我們將嘗試以不同的免疫方法,途徑和動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步提高這兩種疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1371407