發(fā)布時(shí)間：2018-01-02 11:22

  本文關(guān)鍵詞：基于聚乙烯亞胺為骨架的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的研究　出處：《浙江大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 基因治療是指將人體正�；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的治療方式。運(yùn)載遺傳物質(zhì)的工具稱為載體。一項(xiàng)完整的基因治療實(shí)施方案包括目的基因、轉(zhuǎn)基因載體、靶細(xì)胞和實(shí)施途徑的選擇等四方面的內(nèi)容。目前常用的轉(zhuǎn)基因載體包括病毒載體和非病毒轉(zhuǎn)基因載體兩大類。其中病毒載體在目前的科研工作和臨床試驗(yàn)中是主要使用的載體，占到95％以上。但是病毒載體具有一些難以克服的缺陷，如制備復(fù)雜、攜帶能力有限、靶向特異性差、高免疫原性、體內(nèi)不能重復(fù)使用、可能導(dǎo)致感染的潛在危險(xiǎn)和引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等，所以近20余年來有越來越多的研究者將視線放在了非病毒載體上面。非病毒載體包括脂質(zhì)體、納米粒、膠團(tuán)等，具有成本低、制備相對簡單、容易批量生產(chǎn)、攜帶遺傳物質(zhì)容量大、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，但也有轉(zhuǎn)基因效率相對低下、本身并無特異細(xì)胞或組織靶向性等缺點(diǎn)。 聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是由酸催化氮丙啶單體聚合而形成的一種聚合物。自從約15年前發(fā)現(xiàn)其可以縮合質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)后，PEI作為轉(zhuǎn)基因載體引起了研究人員的廣泛關(guān)注。根據(jù)合成路線的不同，PEI具有線狀和支鏈狀兩種結(jié)構(gòu)，分子量范圍在＜1000 Da到1.6×10~3 kDa之間，在轉(zhuǎn)基因載體領(lǐng)域，以分子量為22 kDa和25 kDa的PEI應(yīng)用最廣。在生理pH下，游離的PEI每5-6個(gè)氨基氮中有一個(gè)氨基氮可以被質(zhì)子化(約20％)，結(jié)合了核酸之后，每2-3個(gè)氨基氮中即有一個(gè)可以被質(zhì)子化，進(jìn)入內(nèi)含體和溶酶體后，pH下降，PEI的氨基氮能夠進(jìn)一步發(fā)生質(zhì)子化(pH為5.0時(shí)，質(zhì)子化程度為45％)，大量捕獲質(zhì)子，并引起Cl~-離子內(nèi)流，導(dǎo)致溶酶體滲透性腫脹，無需溶酶體溶解肽的輔助作用溶酶體即可破裂，從而將內(nèi)吞的DNA釋放到細(xì)胞漿而最終入核。雖然PEI作為一種轉(zhuǎn)基因效率相對較高的非病毒載體，已經(jīng)成為非病毒載體領(lǐng)域衡量其他類型載體效率的一個(gè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是其本身仍具有不少缺點(diǎn)如相對于病毒載體轉(zhuǎn)基因效率低、高分子量PEI毒性大、無法生物降解、無特異細(xì)胞或組織的靶向性以及體內(nèi)應(yīng)用有諸多障礙等，這些缺點(diǎn)明顯限制了PEI的實(shí)際應(yīng)用。為了克服PEI上述的不利于轉(zhuǎn)基因以及體內(nèi)使用的缺點(diǎn)，構(gòu)建理想的轉(zhuǎn)基因載體，需要對PEI進(jìn)行改造。目前主要改造思路有配體化、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化等，但尚無成熟商品化產(chǎn)品。 本研究的目的在于改造PEI，構(gòu)建具有高轉(zhuǎn)基因效率、低毒性、具有腫瘤細(xì)胞和組織的特異靶向性以及適合體內(nèi)靜脈途徑使用的轉(zhuǎn)基因載體。整個(gè)研究分成三部分，在以分子量為25 kDa的PEI(PEI25k)為骨架的基礎(chǔ)上，分別通過雙靶向配體肽偶聯(lián)、PEG化以及以多臂PEG為核心偶聯(lián)低分子量PEI三種修飾策略，設(shè)計(jì)了3類新型載體。詳細(xì)研究了載體的合成過程、理化特性、縮合質(zhì)粒DNA的能力、體內(nèi)外毒性、體外相應(yīng)細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)基因效率、特異細(xì)胞的靶向作用以及在體內(nèi)荷瘤動物模型中的轉(zhuǎn)基因活性，以期得到可以在腫瘤的基因治療中發(fā)揮重要作用的理想載體并部分闡明其轉(zhuǎn)基因的機(jī)制。 在第一部分研究中，鑒于大部分腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFR)和整合素(integrin)，作者選擇了靶向于FGFR的多肽YRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKC(YC25)和靶向于整合素的含RGD肽CYGGRGDTP(CP9)兩條肽，分別偶聯(lián)到PEI25k上，構(gòu)建了雙受體靶向的載體(YC25-PEI-CP9)，觀察合成的載體是否具有轉(zhuǎn)基因效率提高并有特異細(xì)胞的靶向性等優(yōu)點(diǎn)。在該部分研究中，先利用細(xì)胞免疫組織化學(xué)的方法和FITC標(biāo)記的YC25肽篩選出了FGFR陽性的COS-7、HeLa細(xì)胞和FGFR陰性的PC-3細(xì)胞作為研究的工具細(xì)胞。在FTIR圖譜和紫外吸收圖譜上，1630cm~(-1)處的吸收峰和270 nm附近的吸收峰出現(xiàn)提示肽的成功偶聯(lián)。通過計(jì)算~1H NMR圖譜上甲基基團(tuán)中質(zhì)子峰、苯環(huán)中質(zhì)子峰以及PEI中質(zhì)子峰的積分，驗(yàn)證了雙靶向載體中YC25和CP9與PEI25k的偶聯(lián)率分別為3.6和6.4。凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明了YC25-PEI-CP9在N／P比為4的時(shí)候可以完全縮合質(zhì)粒DNA。利用透射電鏡發(fā)現(xiàn)N／P比為10的時(shí)候，YC25-PEI-CP9可以將質(zhì)粒DNA縮合成粒徑約為200 nm的類圓形納米粒(polyplexes)。Polyplexes的粒徑通過進(jìn)一步的粒徑測定驗(yàn)證。表面電荷測定結(jié)果表明在N／P比為10的時(shí)候，YC25-PEI-CP9和質(zhì)粒DNA形成的polyplexes的表面電荷為30.9±3.6mV。在COS-7細(xì)胞中的MTT毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明YC25-PEI-CP9毒性略低于PEI25k。在COS-7細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)YC25-PEI-CP9在N／P比為10的時(shí)候，具有最高的效率，不僅要遠(yuǎn)高過PEI25k，也要高于單配體肽偶聯(lián)的PEI25k。但在PC-3細(xì)胞中，以CP9肽單偶聯(lián)的PEI25k效率最好。隨后在HeLa細(xì)胞中的游離肽抑制實(shí)驗(yàn)證明了偶聯(lián)的兩條肽的靶向作用。體內(nèi)荷瘤動物模型實(shí)驗(yàn)中，雙靶向的載體也在荷HeLa腫瘤裸鼠中顯示了最好的轉(zhuǎn)基因效率，而在荷PC-3腫瘤裸鼠中CP9肽單偶聯(lián)的PEI25k顯示了良好的效率。大小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明YC25-PEI-CP9的毒性顯為PEI25k的一半左右。通過本部分的研究，作者成功構(gòu)建的雙受體靶向的載體YC25-PEI-CP9，其具有轉(zhuǎn)基因效率高、特異腫瘤細(xì)胞和組織靶向性好等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也有毒性大、所形成的polyplexes呈現(xiàn)較高表面電荷而不適合體內(nèi)靜脈途徑使用等缺點(diǎn)。 在第二部分研究中，為了屏蔽PEI25k表面陽性電荷，降低載體毒性，使構(gòu)建的載體適合體內(nèi)使用，作者利用PEI25k為骨架，以分子量3400 Da的PEG作為電荷屏蔽基團(tuán)，并結(jié)合特異靶向于FGFR的肽GT10，構(gòu)建了偶聯(lián)率分別為1、2和4的PEG化的靶向載體PEI-PEG-GT10(1、2、4)。在本部分研究中首先用FITC標(biāo)記的GT10經(jīng)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了NIH3T3、HepG2細(xì)胞可以和GT10結(jié)合，而PC-3細(xì)胞則不能，并用此三種細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)工具細(xì)胞使用。FTIR結(jié)果上1732 cm~(-1)處吸收峰的消失以及1658 cm~(-1)處吸收峰的出現(xiàn)提示合成過程的成功。通過~1H NMR結(jié)果驗(yàn)證了PEG以及肽相對于PEI25k的偶聯(lián)率分別為1、2和4。凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEI-PEG-GT10在N／P比4～5以上時(shí)可以完全縮合質(zhì)粒DNA。粒徑檢測表明在N／P比＞30的時(shí)候，PEI-PEG-GT10(1)可以將質(zhì)粒DNA縮合成粒徑為200 nm左右的納米粒，，而且可以抵抗隨著時(shí)間的延長導(dǎo)致的聚集現(xiàn)象。透射電鏡觀察PEI-PEG-GT10與質(zhì)粒DNA在N／P比為30時(shí)形成類圓形的納米粒，邊緣結(jié)構(gòu)偏疏松。其后的表面電荷測定結(jié)果表明在N／P比為30時(shí)，PEI-PEG-GT10形成的polyplexes表明電荷接近中性。體外毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PEI-PEG-GT10毒性要遠(yuǎn)低于PEI25k。體外在NIH3T3細(xì)胞中的篩選實(shí)驗(yàn)表明PEI-PEG-GT10(1)在N／P比為30的時(shí)候，具有最高的轉(zhuǎn)基因效率。在HepG2細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn)，而在PC-3細(xì)胞中，GT10肽的偶聯(lián)未能顯示出更好的促轉(zhuǎn)基因作用。在NIH3T3細(xì)胞中的游離肽抑制實(shí)驗(yàn)證明了GT10肽的靶向作用。隨后的血清體系轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明PEI-PEG-GT10(1)具有抵抗血清抑制轉(zhuǎn)基因的作用。在大小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)中，PEI-PEG-GT10(1)的毒性遠(yuǎn)低于PEI25k。而在荷HepG2細(xì)胞的裸鼠中，尾靜脈注射PEI-PEG-GT10(1)顯示了腫瘤組織的良好轉(zhuǎn)基因效率，當(dāng)PEI-PEG-GT10(1)攜帶pCSK-α-IFN質(zhì)粒后，能夠明顯抑制腫瘤的生長。通過本部分的研究，作者成功構(gòu)建了不同偶聯(lián)率的PEG化的靶向于腫瘤細(xì)胞FGFR的PEI25k載體，其具有轉(zhuǎn)基因效率高、能抵抗血清抑制效應(yīng)、特異細(xì)胞和組織靶向性好并適合于體內(nèi)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但仍具有一定毒性。 在第三部分研究中，鑒于低分子量PEI具有毒性低的特點(diǎn)，結(jié)合PEG所具有的屏蔽陽性電荷的作用，為了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因效率高、低毒性并適合體內(nèi)應(yīng)用的載體，作者以8臂的PEG(8armPEG)為核心，將分子量為600Da的PEI(PEI600)串聯(lián)成大分子量的聚合物(8armPEG-PEI600)，并在PEI600上偶聯(lián)靶向于腫瘤細(xì)胞表面FGFR的肽MC11(8armPEG-PEI600-MC11)。通過FTIR檢測1730 cm~(-1)以及1670 cm~(-1)處吸收峰的生成和消減證明了偶聯(lián)的成功；通過TGA觀察成功合成的8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11的熱分解性質(zhì)發(fā)生了改變；其后通過GPC以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11的分子量，與理論值非常接近；而~1H NMR的結(jié)果則進(jìn)一步證明了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11中各組件的偶聯(lián)率符合理論值。凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8armPEG-PEI600和8armPEG-PEI600-MC11均在N／P比為3的時(shí)候，可以完全縮合質(zhì)粒DNA，而PEI600則需要N／P比達(dá)到4方可縮合質(zhì)粒DNA。通過粒徑和表面電荷的檢測，可以發(fā)現(xiàn)在N／P比為30以上時(shí)，8armPEG-PEI600和8armPEG-PEI600-MC11就可以將質(zhì)粒DNA縮合成約200nm大小，表面電荷約為20mV的納米粒。MTT的體外結(jié)果表明了8armPEG-PEI600、8armPEG-PEI600-MC11和PEI600相似，是毒性極低的聚合物。之后分別以HepG2和PC-3細(xì)胞為工具細(xì)胞，驗(yàn)證了合成的聚合物的轉(zhuǎn)基因效率。結(jié)果表明，在兩種細(xì)胞中，8armPEG-PEI600在N／P比為30的時(shí)候，均可以達(dá)到最好的效率，略低于N／P比為10時(shí)的PEI25k。但是對于8armPEG-PEI600-MC11而言，在HepG2細(xì)胞中，N／P比為30的時(shí)候，轉(zhuǎn)基因效率大幅上升，是PEI25k的11倍，而在PC-3細(xì)胞中，則沒有這種效率增加效應(yīng)。通過肽抑制實(shí)驗(yàn)，可以證明在FGFR陽性的HepG2細(xì)胞中游離肽對8armPEG-PEI600-MC11的轉(zhuǎn)基因具有抑制效應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明polyplexes經(jīng)尾靜脈注射荷瘤裸鼠后，由8armPEG-PEI600所形成的polyplexes已經(jīng)有很大一部分可以到達(dá)腫瘤組織，轉(zhuǎn)基因效率是PEI25k的6倍。而由8armPEG-PEI600-MC11所形成的polyplexes在腫瘤組織中的轉(zhuǎn)基因效率又是8armPEG-PEI600的3.1倍。如果載體攜帶pCSK-α-IFN治療腫瘤，8armPEG-PEI600-MC11組顯示了較好的治療效果。通過本部分的研究，作者成功構(gòu)建了載體8armPEG-PEI600-MC11，其具有轉(zhuǎn)基因效率高、毒性極低、特異細(xì)胞組織靶向性好等優(yōu)點(diǎn)，但其和質(zhì)粒DNA形成的polyplexes呈現(xiàn)相對較高的表面電荷影響了其體內(nèi)應(yīng)用。 綜上所述，本研究通過三種偶聯(lián)策略，成功地合成了FGFR和整合素雙靶向的PEI25k載體、FGFR靶向的PEG化的PEI25k載體以及8armPEG為核心的串聯(lián)小分子PEI600的并靶向于FGFR的載體。合成的新型載體都能夠在一定的條件下將質(zhì)粒DNA縮合成適合于轉(zhuǎn)基因的polyplexes，且具有相應(yīng)受體陽性細(xì)胞的靶向性，體外應(yīng)用具有轉(zhuǎn)基因效率高等特點(diǎn)，體內(nèi)應(yīng)用有一定的效果。相對于PEI25k而言，三類載體各有優(yōu)點(diǎn)，如均有體外轉(zhuǎn)基因效率高、靶向性好等特點(diǎn)，但亦各有缺點(diǎn)，如YC25-PEI-CP9毒性較大，相應(yīng)形成的polyplexes的高表面電荷使其不適合靜脈使用；PEG化的PEI25k仍具有一定毒性，主骨架高分子量的PEI25k無法降解；8armPEG為核心的載體形成的相應(yīng)polyplexes也是呈現(xiàn)相對高的表面陽性電荷，影響靜脈使用等。本研究橫跨有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、高分子化學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，多學(xué)科的結(jié)合為轉(zhuǎn)基因載體的開發(fā)工作提供了嶄新的研究思路。研究中所選的靶向位點(diǎn)在腫瘤的靶向基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。多種理化分析手段、靶向肽的設(shè)計(jì)和偶聯(lián)策略等內(nèi)容具有創(chuàng)新性。合成過程線路明確，重復(fù)性好，所需要的合成條件可行性好，為載體的大規(guī)模工業(yè)制備奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。雖然合成的載體離理想轉(zhuǎn)基因載體的 要求尚有一定距離，但相信通過進(jìn)一步完善載體的構(gòu)建策略如將PEG等分子整合入PEI主骨架、對PEI的氨基進(jìn)行�；⒃赑EI單體上連接疏水基團(tuán)以及構(gòu)建能同時(shí)攜帶質(zhì)粒DNA和化學(xué)藥物的載體等，一定能獲得適合于全身應(yīng)用的高效率的轉(zhuǎn)基因載體并應(yīng)用于具體的基因治療方案。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1368964