本文關(guān)鍵詞：LPS預(yù)處理PMNs提取液對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及機(jī)制研究　出處：《中南大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)進(jìn)入體內(nèi)后,刺激單核—巨噬細(xì)胞(如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)和血管內(nèi)皮細(xì)胞,釋放前炎癥介質(zhì),這些細(xì)胞因子和細(xì)胞活性物質(zhì)進(jìn)一步活化多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)等炎癥效應(yīng)細(xì)胞,參與炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程。谷氨酸(glutamate,Glu)是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(center nerve system,CNS)的興奮性氨基酸,通過作用于神經(jīng)元上的Glu受體發(fā)揮生理作用。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是離子型的Glu受體之一,介導(dǎo)由Glu及其他相關(guān)內(nèi)源性酸性氨基酸的興奮作用。已有的研究證實(shí),高濃度的Glu的神經(jīng)毒性作用是導(dǎo)致感染性腦損傷的重要原因之一。最近研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)甲酰甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(formylmethionyl leucyl phenylalanine,fMLF)處理的人PMNs可以釋放Glu,并參與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascularendothelial cells,BMECs)通透性的調(diào)節(jié)。那么,在CNS感染性疾病的發(fā)生發(fā)展中,LPS刺激PMNs后能否產(chǎn)生Glu并作用于相應(yīng)的NMDAR使BMECs通透性發(fā)生改變?目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本實(shí)驗通過了解經(jīng)LPS預(yù)處理PMNs提取液對大鼠BMECs通透性改變的影響,來探討感染性腦水腫腦損傷早期血腦屏障(blood brain barrier,BBB)通透性改變的可能機(jī)制。 方法1.用Percoll非連續(xù)密度梯度沉降法分離、提純健康志愿者外周靜脈血PMNs,瑞氏染色觀察PMNs形態(tài),臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性。2.用100μg/ml LPS預(yù)處理PMNs后置于37℃5%CO_2恒溫培養(yǎng)箱,分別于5、15、30、45、60、90 min 6個時間點(diǎn)離心后提取無細(xì)胞上清液,LC-6A高效液相色譜熒光檢測法測定其Glu濃度。3.原代分離、純化培養(yǎng)大鼠BMECs,Ⅷ因子鑒定其細(xì)胞屬性。4.將體外培養(yǎng)的單層BMECs分為6組:正常對照組,LPS預(yù)處理PMN提取液組,LPS預(yù)處理組,PMNs提取液預(yù)處理組,MK-801預(yù)處理組,Glu預(yù)處理組,分別給予相應(yīng)預(yù)處理后,γ計數(shù)儀檢測~(125)I-牛血清白蛋白(~(125)I-BSA)通過量評價BMECs通透性。5.Western-blotting檢測正常對照組、LPS預(yù)處理PMNs提取液組、LPS預(yù)處理組、PMNs提取液預(yù)處理組、Glu預(yù)處理組、陽性對照組BMECs上NMDAR1的表達(dá)變化。 結(jié)果1.外周靜脈血PMNs瑞氏染色可見大量的分葉核的中性粒細(xì)胞,PMNs純度為97.6%±0.57%,PMNs的回收率為89.7%±7.4%,臺盼藍(lán)染色活率＞98%,PMNs形態(tài)改變＜8%。2.LPS預(yù)處理PMNs 5 min亞組Glu濃度最高為6.319±1.454(μmol/L),與正常對照組比較差異有顯著性意義(P＜0.01);3.Ⅷ因子免疫組化顯示,95%以上的分離細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)黃色(DAB顯色),而無單抗組無顯色,表明培養(yǎng)的細(xì)胞95%以上屬于BMECs。4.正常對照組,LPS預(yù)處理PMN提取液組,LPS預(yù)處理組,PMNs提取液預(yù)處理組,MK-801預(yù)處理組,Glu預(yù)處理組分別干預(yù)240min后,BMECs對~(125)I-BSA通透性指標(biāo)Bake均數(shù)分別為:339.67±17.74、831.17±10.15、737.17±14.63、495.5±10.56、423.83±10.63、903.67±40.63,LPS預(yù)處理PMNs提取液組較正常對照組比較差異有顯著性意義(P＜0.01);5.Western-blotting證實(shí)LPS預(yù)處理PMNs提取液組NMDAR1表達(dá)明顯上調(diào),其OD值為14.966±1.403(正常對照組條帶為1,作為參照值),與正常對照組、LPS預(yù)處理組、PMNs提取液預(yù)處理組比較差異均有顯著性意義(P＜0.01)。 結(jié)論本研究首次證實(shí):LPS預(yù)處理可以使PMNs釋放高濃度Glu,而PMNs釋放的Glu可導(dǎo)致BMECs通透性增加,促使BBB屏障功能改變,其機(jī)制可能與BMECs上的NMDAR1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
[Abstract]:The purpose of lipopolysaccharide (lipopolysaccharide, LPS) into the body after the stimulation of monocyte macrophage (monocytes, macrophages, lymphocytes) and vascular endothelial cells, release of proinflammatory cytokines and cell activity, these substances will activate pleomorphic cells in nuclear particles (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) and other inflammatory cells. The occurrence and development process involved in inflammatory disease. Glutamate (glutamate, Glu) is widely distributed in the central nervous system (center nerve system, CNS) of the excitatory amino acids, by acting on the neuronal Glu receptor play a physiological role of.N- methyl -D- aspartate receptor (N-methyl-D-aspartate, receptor, NMDAR) is one of the ionotropic Glu receptor mediated. Guided by the excitatory effect of Glu and other related endogenous acidic amino acids. Research has confirmed that the neurotoxic effects of high concentrations of Glu is the result of feeling With one of the important reasons for brain injury. Recent studies found that the fmet Leu Phe (formylmethionyl leucyl, phenylalanine, fMLF) treated human PMNs can release Glu, and participate in brain microvascular endothelial cells (brain microvascularendothelial cells, BMECs) permeability regulation. Then, CNS in the occurrence and development of infectious diseases in LPS, Glu and PMNs after stimulation can produce effects on NMDAR BMECs permeability change? There is no related reports. In this experiment, through the understanding of pretreatment with LPS PMNs extract effect on the permeability of BMECs rats, to investigate the infection of brain edema in early stage of brain injury of blood brain barrier (blood brain barrier, BBB) the mechanism of the permeability change.
Methods 1. Percoll discontinuous density gradient sedimentation separation, purification of PMNs venous blood from healthy volunteers peripheral, the morphology of PMNs was observed with Wright staining, trypan blue staining was used to detect the activity of.2. cells with 100 g/ml LPS after PMNs pretreatment in 37 DEG 5%CO_2 incubator, 5,15,30,45,60,90 min respectively in the 6 time points after centrifugal extraction cell free supernatant, determination of fluorescence detection in high performance liquid chromatography LC-6A the concentration of Glu.3. in primary cultured rat BMECs isolation, purification and identification of the properties of the.4. cell factor in vitro monolayer BMECs were divided into 6 groups: normal control group, LPS pretreatment PMN extract group, LPS pretreatment group, PMNs extract pretreatment group, MK-801 pretreatment group, Glu pretreatment group were given corresponding pretreatment, gamma counter detection of ~ (125) I- bovine serum albumin (~ (125) I-BSA) by evaluating the permeability of BMECs.5.Western-blotting detection of the normal control group LPS pretreated PMNs extract group, LPS preconditioning group, PMNs extract pretreatment group, Glu preconditioning group, and positive control group BMECs NMDAR1 expression changes.
Results 1. peripheral blood neutrophil PMNs Wright staining showed a large number of lobocytes, the purity of PMNs was 97.6% + 0.57%, the recovery rate of PMNs was 89.7% + 7.4%, trypan blue staining of live rate was over 98%, the changes of PMNs < 8%.2.LPS pretreatment PMNs 5 min subgroups were the highest Glu concentration was 6.319 + 1.454 (mol/L), there was significant difference compared with the normal control group (P < 0.01); 3. factor immunohistochemistry showed that the separation of cells more than 95% yellow (DAB color), and no mAb group showed no color, showed that more than 95% cultured cells were BMECs.4. normal control group LPS, PMN extracts pretreatment group, LPS pretreatment group, PMNs extracts pretreatment group, MK-801 pretreatment group, Glu pretreatment group respectively after 240Min intervention, BMECs ~ (125) I-BSA permeability indexes of Bake were respectively: 339.67 + 17.74831.17 + 10.15737.17 + 14.63495.5 + 10.56423.83 + 10.63903.67 + 40.63 LPS, PMNs extracts pretreatment group than in the control group had significant difference (P < 0.01); 5.Western-blotting confirmed that LPS pretreatment PMNs extract group NMDAR1 expression was significantly increased, the OD value was 14.966 + 1.403 (normal control group with 1 as the reference value), and the normal control group, LPS the pretreatment group, PMNs extracts pretreatment group was significantly different (P < 0.01).
Conclusion this study confirms for the first time that LPS pretreatment can make PMNs release high concentration Glu, while PMNs released Glu can increase BMECs permeability and promote BBB barrier function. The mechanism may be related to the up regulation of NMDAR1 expression on BMECs.

【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R363

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本文編號：1359641