本文關(guān)鍵詞：PRAK相互作用蛋白的酵母雙雜交篩選及DJ-1與PRAK相互作用的研究　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： p38絲裂原蛋白激活激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一種應(yīng)激激活的絲／蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK超家族；目前已發(fā)現(xiàn)p38 MAPK家族成員有p38α、p38β、p38γ、p38δ，分子量約38～40 kD。各個(gè)亞型之間的不同功能部分與它們在不同組織的表達(dá)，激活方式以及底物特異性相關(guān)，不同的p38能被細(xì)胞應(yīng)激(紫外線輻射、滲透性休克、熱休克、脂多糖、蛋白合成抑制劑)、某些細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α等激活。 細(xì)胞應(yīng)激或細(xì)胞表面受體與配體的結(jié)合介導(dǎo)p38的激活是一種由特定的激酶通過一種高度保守的三級激酶模式(MKKK／MKK／MAPK)而激活的過程。p38是在蘇氨酸(threonine，Thr)-甘氨酸(glycine，Gly)-酪氨酸(tyrosine，Tyr)活化基團(tuán)中Thr和Tyr雙位點(diǎn)上被磷酸化而激活。能磷酸化激活p38的蛋白激酶有絲裂原激活蛋白激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase 3，MKK3)和MKK6。這兩種MKK都能被轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1(transforming growthfactor-β-activated kinase 1，TAK1)、凋亡信號通路調(diào)控激酶1(apoptosissignal-regulating kinase 1，ASK1)、含SH3結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸的蛋白激酶(Srchomology domain 3-containing proline-rich protein kinase，SPRK)、p21激活激酶(p21-activated kinase，PAK)等激活。 p38被激活后將磷酸化一些特異性底物，包括多種轉(zhuǎn)錄因子，如轉(zhuǎn)錄激活因子2(activating transcription factor 2，ATF2)、C／EBP-β和C／EBP同源蛋白10(C／EBPbetaand C／EBP-homologous protein 10，CHOP10)、肌細(xì)胞結(jié)合增強(qiáng)因子2C(myocyteenhancer binding factor-2C，MEF2C)、Myc相關(guān)因子x(Myc-associated factor X，Max)，蛋白激酶，如MAPK激活蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase-activatcd protein kinase 2，MAPKAPK2)和MAPKAPK3、p38調(diào)控激活蛋白激酶(p38-regulated／activated protein kinase，PRAK)、MAPK作用激酶1(MAP kinase integrating kinase,，MNK1)和MNK2等。 由于p38能磷酸化許多不同的底物，因而有理由認(rèn)為p38具有許多不同的生物學(xué)功能。p38 MAPK的激活涉及到細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等過程。同時(shí)，也涉及到炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控、細(xì)胞骨架重組等，在多種疾病過程都發(fā)揮重要作用，如在心肌肥大、缺血／再灌注損傷、神經(jīng)元病理、感染性疾病、創(chuàng)傷愈合和組織重塑中等。 PRAK是一個(gè)受p38調(diào)控的絲氨酸／蘇氨酸激酶，由471個(gè)氨基酸組成，分子量約54 kD；有關(guān)PRAK的功能研究目前存在著一些爭議，一些研究認(rèn)為在細(xì)胞應(yīng)激和致炎因子的刺激下，細(xì)胞中的PRAK能被p38磷酸化激活，被激活的PRAK轉(zhuǎn)而磷酸化激活小分子量熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，從而介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。但近年來，另一些研究發(fā)現(xiàn)PRAK能夠被非典型的MAPK家族成員ERK3磷酸化激活，而p38α／β對PRAK的磷酸化激活只有當(dāng)p38和PRAK都在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過度表達(dá)時(shí)才會(huì)發(fā)生。這一結(jié)果提示，PRAK在體內(nèi)可能參與了ERK3信號傳導(dǎo)通路，而在正常生理狀況下p38可能并不是PRAK的上游調(diào)控激酶。另外，有關(guān)HSP27是否是PRAK的底物，目前也存在著爭議，有研究發(fā)現(xiàn)重組的GST-PRAK在體外雖然能被p38激活并磷酸化HSP27，但通過免疫共沉淀得到的內(nèi)源性PRAK在體外并不能磷酸化HSP27。在受到NaAsO_2刺激的野生型和PRAK缺陷型細(xì)胞中，都能檢測到相近程度的HSP27的激活，提示HSP27在細(xì)胞內(nèi)的激活可能并不完全受PRAK的調(diào)控。因此HSP27是否是PRAK的底物以及PRAK的底物到底有那些蛋白還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。內(nèi)源性PRAK主要定位于胞質(zhì)中；而外源性表達(dá)的PRAK則主要位于細(xì)胞核中。序列分析表明，PRAK同時(shí)含有一個(gè)核輸出信號(nuclaer export sequence，NES)和一個(gè)核定位信號(nuclear localization sequence，NLS)，而這兩者對于PRAK的穿梭而言是必不可少的。在受到刺激后，由于PRAK入核減少而出核增加，導(dǎo)致核中的PRAK減少。PRAK的入核不依賴于p38的激活，但出核則依賴于p38對其磷酸化。因而，PRAK的亞細(xì)胞分布由多種因素決定，而且PRAK在胞質(zhì)與胞核之間的穿梭到底介導(dǎo)哪些細(xì)胞功能也不清楚。 可以看出，p38 MAPK信號通路具有廣泛和復(fù)雜的生物學(xué)功能，PRAK作為該通路中的重要成員一直是研究的熱點(diǎn)。但目前我們對其認(rèn)識還十分有限，并且在許多問題上還存在著一些爭議。為了進(jìn)一步研究PRAK的功能，及其可能的下游底物和上游激酶，我們利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)篩選了與PRAK相結(jié)合的蛋白。 酵母雙雜交是研究蛋白質(zhì)相互作用的重要方法和手段。該方法的基本原理是利用轉(zhuǎn)錄激活因子(transcription activator，TA)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain，BD)和DNA激活結(jié)構(gòu)域(DNA-activating domain，AD)可以分為兩個(gè)空間上相互獨(dú)立的功能單位這一特性，將“誘餌”蛋白與BD相融合，將可能與之相互作用的蛋白或被篩選的文庫與AD融合。如果兩者之間在酵母細(xì)胞內(nèi)有相互作用，即使AD和BD在空間上相互靠近，啟動(dòng)下游的報(bào)告基因。目前這一系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于文庫篩選、蛋白質(zhì)相互作用鑒定以及蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域鑒定等方面。相比于其他方法，酵母雙雜交系統(tǒng)具有更能模擬真核細(xì)胞內(nèi)的作用環(huán)境、敏感性高、特異性好、高效等特點(diǎn)；而且經(jīng)改進(jìn)后的一些雙雜交系統(tǒng)還能應(yīng)用于膜蛋白之間相互作用、轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白質(zhì)之間相互作用的驗(yàn)證，以及蛋白復(fù)合體之間相互作用的驗(yàn)證等。 經(jīng)過篩選，我們共得到3個(gè)可能與PRAK結(jié)合的蛋白，分別是MASP1(homo sapiens mannan-binding lectin serine protease 1)、SEPT8(homo sapiens septin 8)和DJ-1。DJ-1基因是由Daisuke Nagakubo等人在1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的絲裂原依賴性癌基因，，其編碼的DJ-1蛋白能夠協(xié)同Ras蛋白引起小鼠NIH3T3細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。該蛋白廣泛表達(dá)于人體各種組織，尤其在睪丸、前列腺、骨骼肌、腎臟、心臟、肝臟等組織中，表達(dá)量較高，并以二聚體的形式參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，如腫瘤發(fā)生、受精、雄激素受體調(diào)控、分子伴侶、抗氧化以及調(diào)控RNA結(jié)合復(fù)合體與RNA的結(jié)合等。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道PRAK能夠被H_2O_2刺激激活，并且參與了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)在氧應(yīng)激時(shí)應(yīng)力纖維的形成。而DJ-1在氧化應(yīng)激時(shí)，能通過“扮演”分子伴侶、清道夫蛋白以及以致凋亡通路等多種方式有效地保護(hù)細(xì)胞抵抗氧自由基的損傷。在抑制細(xì)胞凋亡方面，DJ-1主要是通過與細(xì)胞核中Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas death domain-associated protein，Daxx)蛋白結(jié)合，抑制其出核，阻斷下游激酶ASK1的激活，最終抑制凋亡途徑。但DJ-1序列中并沒有NLS，因此DJ-1如何入核一直是一個(gè)迷。根據(jù)前期研究和我們篩選的結(jié)果，我們提出了關(guān)于DJ-1與PRAK的設(shè)想，即在氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的PRAK和DJ-1會(huì)被激活，表達(dá)量上調(diào)，這時(shí)胞漿中的部分DJ-1就會(huì)與PRAK結(jié)合，并被PRAK通過某種方式攜帶入細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核的DJ-1就能與核內(nèi)的Daxx蛋白結(jié)合并抑制其進(jìn)入胞漿，使得胞漿中的ASK1激酶不能被激活，最終起到抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞的抗氧化的功能。 如果上述假設(shè)能夠得到證實(shí)，對有關(guān)DJ-1和PRAK的功能研究具有重要意義，并且能夠以DJ-1和PRAK為切入點(diǎn)將p38信號通路與細(xì)胞凋亡途徑聯(lián)系起來。為此我們對DJ-1的定位、移位、抗氧化應(yīng)激功能和DJ-1與PRAK的相互作用進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DJ-1與PRAK在體外可以特異性地結(jié)合。隨后，我們通過綠色熒光蛋白示蹤的方法發(fā)現(xiàn)，在正常情況下，DJ-1在細(xì)胞的胞漿、胞核都有表達(dá)，但以胞漿居多；在血清以及H_2O_2刺激情況下部分細(xì)胞中的DJ-1會(huì)從胞漿移位到胞核，這初步證實(shí)了我們關(guān)于DJ-1在氧化應(yīng)激的情況下會(huì)入核的假設(shè)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)，HA-PRAK和pEGFP-DJ-1在部分NIH3T3細(xì)胞的胞核中存在共定位，推測PRAK與DJ-1的共定位與細(xì)胞周期有關(guān)，因?yàn)橛形墨I(xiàn)報(bào)道，DJ-1的在血清刺激下的入核與細(xì)胞周期有關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)和HA-PRAK共轉(zhuǎn)時(shí)，胞核中EGFP-DJ-1的表達(dá)量有一定程度的升高，這一現(xiàn)象進(jìn)一步被核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，這提示DJ-1和PRAK在胞核中存在相互作用。但是Flag-DJ-1與HA-PRAK在NIH3T3以及HEK293細(xì)胞中的免疫共沉淀未能測到陽性結(jié)果，這可能與我們所推測的PRAK與DJ-1僅在細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期，才在細(xì)胞核內(nèi)有共定位有關(guān)，因此我們還需要進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法和條件，以獲得確切的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后我們將HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag-DJ-1作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染pcDNA3-Flag空載體和不轉(zhuǎn)染組作為兩個(gè)陰性對照，采用不同濃度的H_2O_2刺激24h，通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)，與兩個(gè)對照組相比，在200～600μmol／L濃度的H_2O_2范圍內(nèi)，pcDNA3-Flag-DJ-1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力明顯較好，提示在該H_2O_2濃度刺激范圍內(nèi)，F(xiàn)lag-DJ-1能有效地保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。 綜上所述，我們利用酵母雙雜交篩選系統(tǒng)，以PRAK為靶蛋白，篩選了人心臟cDNA文庫，得到3個(gè)可能與其相互作用的蛋白，為下一步深入研究PRAK功能和調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的切入點(diǎn)；同時(shí)將篩選到的一個(gè)可能與PRAK有結(jié)合的蛋白DJ-1，克隆到真核以及原核表達(dá)載體上，做了體內(nèi)、體外的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，證實(shí)兩者在體外能夠特異性結(jié)合；并在NIH3T3細(xì)胞核中存在共定位，過度表達(dá)的PRAK還能夠影響DJ-1的亞細(xì)胞定位，促進(jìn)DJ-1移位入核。最后，還對DJ-1在真核細(xì)胞中的表達(dá)定位及與應(yīng)激刺激關(guān)系作了初步探討，發(fā)現(xiàn)在靜息狀態(tài)下，DJ-1彌散分布在細(xì)胞的胞漿、胞核，但以胞漿為主。在受到血清以及H_2O_2刺激以后，部分細(xì)胞中的DJ-1會(huì)從胞漿移位到胞核。最后我們還通過XTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在200-600μmol／L濃度范圍內(nèi)的H_2O_2刺激下，DJ-1能有效地保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1355386