本文關(guān)鍵詞：包含有未生長(zhǎng)卵子和成熟卵子基因組的二倍體小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞的分離和肌肉損傷修復(fù)模型的建立　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 在缺少雄性配子基因組的情況直接激活成熟卵子能夠形成孤雌囊胚，從這個(gè)孤雌囊胚中可以分離得到孤雌胚胎干細(xì)胞。孤雌胚胎干細(xì)胞的使用避開了倫理問題，可以為再生醫(yī)學(xué)提供種子細(xì)胞來源，在細(xì)胞移植、組織和器官重建方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是與受精胚來源的胚胎干細(xì)胞相比，孤雌胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能是非常有限的。造成這一結(jié)果的原因之一可能是父源性基因組的缺失。以往的報(bào)道證實(shí)未生長(zhǎng)卵子(新生小鼠卵子)在多個(gè)印記基因表達(dá)模式上具有精子基因組的特點(diǎn)。本研究首次應(yīng)用基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)構(gòu)建了包含有未生長(zhǎng)卵子和成熟卵子基因組的二倍體孤雌囊胚(NF-pBlastocysts)：首次建立了三株包含有未生長(zhǎng)卵子和成熟卵子基因組的孤雌胚胎干細(xì)胞系(NF-pES cells)。為了證明NF-pES細(xì)胞具有臨床治療價(jià)值，我們制造了小鼠肌肉損傷修復(fù)模型。結(jié)果顯示，NF-pES細(xì)胞能夠分化形成骨骼肌纖維，參與損傷肌肉的修復(fù)。 作為一個(gè)新型的孤雌胚胎干細(xì)胞，NF-pES細(xì)胞不僅在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景而且也提供了一個(gè)研究基因印記和器官發(fā)育相互關(guān)系的體外研究工具。NF-pES細(xì)胞的分離成功也為建立人類孤雌胚胎干細(xì)胞系提供了一個(gè)新的思路。 1．胚胎干細(xì)胞研究平臺(tái)的建立——建立在絲裂霉素處理的胎兒成纖維細(xì)胞上的胚胎干細(xì)胞的分離與鑒定 由于進(jìn)口的絲裂霉素C屬國(guó)家管制藥品，難以購到而且市場(chǎng)報(bào)價(jià)較貴，所以我們選用國(guó)內(nèi)知名生產(chǎn)商浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)的國(guó)藥準(zhǔn)字H33020786的絲裂霉素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)絲裂霉素濃度為20μg／ml作用4h或30μg／ml作用2h、4h時(shí)，均可有效抑制細(xì)胞的分裂而不影響細(xì)胞活力。小鼠胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)濃度為30μg／ml的絲裂霉素作用2h后制備飼養(yǎng)層，將7枚體內(nèi)受精囊胚種植在該飼養(yǎng)層上，從中共獲得5個(gè)胚胎干細(xì)胞株。經(jīng)鑒定，所有胚胎干細(xì)胞株都表達(dá)堿性磷酸酶活性，Oct-4和SSEA-1陽性，能夠形成具有三個(gè)胚層分化能力的畸胎瘤，其中一個(gè)細(xì)胞株具有生殖系嵌合能力。因此，浙江海正藥業(yè)生產(chǎn)的絲裂霉素不僅對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，而且支持具有生殖系嵌合能力的ES細(xì)胞的分離。國(guó)產(chǎn)絲裂霉素價(jià)格低廉，大大降低了實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)本研究也為國(guó)產(chǎn)藥品在ES細(xì)胞研究中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。 2．包含有未生長(zhǎng)卵子(non-growing oocytes)和成熟卵子(fully grown oocytes)基因組的二倍體孤雌胚胎的構(gòu)建和孤雌胚胎干細(xì)胞(NF-pES cells)系的建立 在應(yīng)用常規(guī)生發(fā)泡移植技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)二倍體孤雌胚胎過程中，GV期卵子的卵周隙是影響去核效率的一個(gè)重要的限制因素。為了解決這一問題，我們發(fā)明了一套基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)程序。具體做法是在去核操作前將GV期卵子的透明帶去除，，將所有卵子都放在濃度為5或25μg／ml CCB的操作液內(nèi)，僅使用一個(gè)顯微操作臂進(jìn)行去核，去核率為83.76％。去核GV期卵子經(jīng)PHA-P與未生長(zhǎng)卵子進(jìn)行粘合，在融合電壓為180V、脈沖寬度為20μs和一次電脈沖下融合效率為62.80％。融合的重構(gòu)卵子在TYH中進(jìn)行成熟培養(yǎng)，成熟率為70.89％�；凇癦ona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)不僅無需依據(jù)卵周隙的大小取舍卵子，減少了切口針對(duì)卵子的破壞和提高了去核效率，而且降低了操作難度，易于為初學(xué)者所掌握。 已有研究證實(shí)未生長(zhǎng)卵子的基因組表達(dá)某些父源性表達(dá)的基因而某些母源性表達(dá)的基因則被抑制。因此未生長(zhǎng)卵子基因組在一定程度上充當(dāng)了精子基因組的作用。本研究應(yīng)用基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術(shù)，使用383枚GV期卵子共獲得64枚來自未生長(zhǎng)卵子的MⅡ期卵子。將這些MⅡ期卵子的核區(qū)移植到體內(nèi)成熟的昆明小鼠MⅡ期卵子的透明帶下，共重構(gòu)成功56枚。經(jīng)電融合處理，有51枚發(fā)生融合。經(jīng)SrCl_2激活后，獲得22枚形成兩個(gè)原核和排出兩個(gè)極體的重構(gòu)胚。將這22枚重構(gòu)胚繼續(xù)體外發(fā)育共得到13枚囊胚。從這13枚囊胚共分離得到3株NF-pES細(xì)胞系。所有NF-pES細(xì)胞株均表達(dá)堿性磷酸酶活性，SSEA-1和Oct-4陽性。選取其中兩株NF-pES細(xì)胞系制備嵌合體。嵌合體鼠的心臟、脾、腎和骨髓的流式細(xì)胞檢驗(yàn)結(jié)果顯示，一株NF-pES細(xì)胞(NF-pES-1)在以上四個(gè)臟器的嵌合率分別是15.07％、41.02％、3.55％和11.53％。另外一株NF-pES細(xì)胞系(NF-pES-2)是83.36％、68.74％、29.70％和50.44％。對(duì)照組受精胚來源的ES細(xì)胞在其嵌合鼠的心臟、脾、腎和骨髓的嵌合率分別是77.96％、84.06％、42.49％和52.02％。方差分析顯示NF-pES-2在心臟、脾和骨髓上的嵌合率與受精胚來源的ES細(xì)胞無顯著差異。這一結(jié)果表明包含有未生長(zhǎng)卵子和成熟卵子基因組的孤雌胚胎干細(xì)胞至少在心臟、脾和骨髓方向發(fā)育上具有和受精胚來源的胚胎干細(xì)胞相當(dāng)?shù)陌l(fā)育潛能，這為孤雌胚胎干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。 3．肌肉損傷修復(fù)模型的建立 NF-pES細(xì)胞來源的畸胎瘤和嵌合體組織中存在大量骨骼肌纖維的事實(shí)表明NF-pES細(xì)胞具有分化成為骨骼肌纖維的潛能。臨床上有一些退行性疾病與肌肉損傷或功能喪失有關(guān)如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等。目前尚無特效藥應(yīng)用于此類疾病的治療。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植是一個(gè)非常有效的辦法。為了證明NF-pES細(xì)胞具有作為移植供體細(xì)胞治療該類疾病的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們使用心臟毒素處理結(jié)合射線照射小鼠的脛骨前肌制造了肌肉損傷模型。首先NF-pES細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成為混合的前體細(xì)胞，然后將這些前體細(xì)胞移植到小鼠脛骨前肌受損部位。一個(gè)月后取材進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示NF-pES細(xì)胞來源的前體細(xì)胞能夠嵌合到骨骼肌組織，并且形成部分骨骼肌纖維。我們的實(shí)驗(yàn)證明了NF-pES細(xì)胞移植具有治療與骨骼肌損傷或功能喪失有關(guān)疾病的應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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