本文關(guān)鍵詞：酵母雙雜交技術(shù)篩選與NS3TP2蛋白結(jié)合的肝細(xì)胞蛋白編碼基因　出處：《鄭州大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 一、背景和目的 丙型肝炎病毒(HCV)屬黃病毒科，可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，，目前世界上有1.7億人感染，治療上只有干擾素和利巴韋林，而且療效有限。對于HCV分子生物學(xué)機(jī)制的闡明是進(jìn)行抗病毒治療和最終戰(zhàn)勝丙型肝炎及相關(guān)疾病的重要前提。HCV基因組轉(zhuǎn)錄翻譯為一條多肽前體，然后在信號肽酶和蛋白酶的作用下裂解為10個蛋白，包括Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中編碼631個氨基酸、大小約70KD的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3是一種多功能蛋白質(zhì)，具有絲氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酸酶(NTPase)和RNA解旋酶(helicase)的功能，在HCV復(fù)制及表達(dá)產(chǎn)物多聚蛋白的裂解加工上起重要作用。研究表明，HCV NS3蛋白還可能通過反式激活作用調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種病毒及細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄，在HCV致病(癌)過程中起著重要的作用。黨曉燕等利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression substractive hybridization)、及生物信息學(xué)技術(shù)(bioinformatics)篩選并克隆了NS3蛋白反式激活的靶基因，發(fā)現(xiàn)它上調(diào)的基因中除了一些已知功能的基因外還包括一些未知功能的基因。其中之一命名為NS3TP2(HCV NS3-transactivated protein 2)，利用生物信息學(xué)技術(shù)確定其ORF，并對其進(jìn)行克隆化研究，順利得到了NS3TP2的基因編碼序列，在GenBank中注冊，注冊號為AY116970。為了進(jìn)一步研究NS3TP2的生物學(xué)功能我們在酵母細(xì)胞中表達(dá)了該蛋白，并利用酵母雙雜交技術(shù)在肝細(xì)胞cDNA文庫中篩選與其作用的蛋白質(zhì)基因，以期為HCV NS3蛋白在HCV致病機(jī)制中的作用的研究提供新的線索。 二、研究方法： 應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)3，將多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增的NS3TP2基因連接入酵母表達(dá)載體pGBKT7中構(gòu)建誘餌質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化單倍體酵母細(xì)胞AH109并在其內(nèi)表達(dá)，提取酵母蛋白質(zhì)，進(jìn)行十二烷基磺鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western免疫印跡分析然后與轉(zhuǎn)化了人肝細(xì)胞文庫質(zhì)粒pACT2的單倍體酵母細(xì)胞Y187進(jìn)行配合，在涂有X-α-半乳糖(X-α-gal)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上進(jìn)行雙重篩選生長，提取陽性酵母克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒DNA，然后將此陽性文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒進(jìn)行回交實驗進(jìn)一步篩選后測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 三、結(jié)果： 成功構(gòu)建NS3TP2蛋白基因酵母表達(dá)載體，Western免疫印跡顯示了NS3TP2蛋白在酵母細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)存在，分子量68 000 kd左右。經(jīng)過回交實驗后篩選出與NS3TP2結(jié)合的蛋白基因6種，其中包括空泡蛋白13同系物A(VSP13A)、脂酰輔酶A合成酶長鏈家族成員5(ACSL5)、線粒體基因、脂酰輔酶A結(jié)合蛋白(r-氨基丁酸受體調(diào)節(jié)因子，苯甲二氮卓結(jié)合抑制因子)、真核翻譯延伸因子alpha 1、環(huán)指蛋白130。 四、結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了pGBKT7-NS3TP2酵母表達(dá)質(zhì)粒。 2．首次在酵母細(xì)胞中成功表達(dá)了pGBKT7-NS3TP2融合蛋白。 3．利用酵母雙雜交技術(shù)成功篩選出了在肝細(xì)胞中與HCVNS3TP2蛋白相互作用的蛋白質(zhì)基因。一類是與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的基因：空泡蛋白13同系物A、環(huán)指蛋白130、真核翻譯延伸因子alpha 1。一類是與脂肪代謝相關(guān)的基因：脂酰輔酶A合成酶長鏈家族成員5(ACSL5)和脂酰輔酶A結(jié)合蛋白(ACBP)。 4．NS3TP2作為HCV NS3反式激活的蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)代謝及脂肪代謝中扮演了一定的角色，尤其是在脂類代謝中，它可能介導(dǎo)了NS3對HCV感染的肝細(xì)胞脂類代謝的影響，在HCV感染患者脂肪肝的發(fā)生上起了一定的作用，為NS3TP2的生物學(xué)功能及HCV NS3致病機(jī)制的研究提供了新的線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1352550