本文關鍵詞：SARS冠狀病毒S蛋白抗原表位分析與定位研究　出處：《中國農業(yè)科學院》2005年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：嚴重急性呼吸綜合癥(Severe acute respiratory syndrome, SARS)是由SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起的人類新發(fā)傳染病,S、M、N、E蛋白是SARS-CoV病毒粒子的幾種主要結構蛋白。用Lasergene軟件系統(tǒng)分析SARS病毒結構蛋白S、M、N蛋白,預測了12個抗原表位,用這些預測表位序列設計組合成四個嵌合基因SSCV-A、SSCV-B、SSCV-C、SSCV-D。人工合成后插入pGEX-6p-1的BamHI和XhoI位點間,構建成融合表達質粒,轉化宿主菌BL21經IPTG誘導后嵌合基因表達產物為可溶性蛋白。經免疫印跡試驗表明嵌合基因表達產物可被SARS康復患者血清所識別,表明重組融合蛋白具有免疫反應性,提示預測表位中含有SARS-CoV結構蛋白的抗原表位。用純化的重組融合蛋白GST-SSCV-D和GST-SSCV-A為抗原制備了一系列單克隆抗體�？筍SCV-D的單抗有兩株,分別為D3D1和D3C5。將6個S蛋白預測表位分別與GST融合表達。在這6個融合蛋白中,GST-S5可以和單克隆抗體D3C5反應,GST-S2可以和單抗D3D1反應。Western blot分析表明兩個單抗所識別的表位均為線性表位。兩個表位分別位于SARS-CoV纖突蛋白的第447至458氨基酸殘基和789至799氨基酸殘基。D3D1表位(447～458)正位于S蛋白與受體結合的結構域中。 2C5是一株SARS-CoV S蛋白特異的有中和活性的單克隆抗體。以2C5為篩選靶分子,篩選噬菌體展示隨機7肽庫。經三輪淘洗后隨機挑選20個噬菌體克隆進行ELISA分析和序列測定。在10個ELISA OD值大于0.2的陽性噬菌體克隆中,有8個噬菌體克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有該序列的噬菌體克隆能競爭抑制SARS-CoV S蛋白抗原與單抗2C5的結合。與SARS-CoV S蛋白序列比對分析發(fā)現該7肽序列散布于S蛋白的第539位到第559位氨基酸上。將S蛋白T_(539)PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT_(559)的21肽與GST進行融合表達,得到了可溶解的融合蛋白。該融合蛋白能不能被單抗2C5識別,但經Western blot分析表明該融合蛋白能被滅活SARS冠狀病毒免疫雞血清識別。表明T_(539)PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT_(559)是S蛋白的一個線性表位,而TPEQQFT為單克隆抗體2C5的模擬表位。 SARS冠狀病毒S蛋白在病毒與宿主細胞受體結合、細胞膜融合及入侵、誘導機體產生中和抗體中起重要作用。S蛋白受體結合結構域的核心區(qū)域為318～510片段。克隆并融合表達了S蛋白318～510片段,分析表明原核表達的受體結合結構域融合蛋白能被SARS康復患者清和高免動物血清所識別。進一步設計了一套23個覆蓋整個該受體結合結構域的長為16氨基酸殘基的部分重疊的短肽,并進行了融合表達。用23個融合蛋白對受體結合結構域進行抗原表位作圖。結果鑒定出兩個抗原表位SRBD3(F_(334)PSVYAWERKKISNCV_(349))和表位D3D1(K_(447)LRPFERDI_(455))。 SARS冠狀病毒S蛋白S1部分在與細胞受體結合以及誘導機體產生保護性中和抗體中發(fā)揮重要作用。用PCR擴增S1(12～672)及S1N(12～510),S1C(318～672)和SRBD(318～510)四個片段。PCR產物分別克隆到表達載體pGEX-6p-1中,經誘導各融合蛋白均以包涵體形式表達。Western
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R373

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本文編號：1350937