本文關(guān)鍵詞：SARS冠狀病毒S蛋白抗原表位分析與定位研究　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2005年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe acute respiratory syndrome, SARS)是由SARS冠狀病毒(SARS-CoV)引起的人類新發(fā)傳染病,S、M、N、E蛋白是SARS-CoV病毒粒子的幾種主要結(jié)構(gòu)蛋白。用Lasergene軟件系統(tǒng)分析SARS病毒結(jié)構(gòu)蛋白S、M、N蛋白,預(yù)測(cè)了12個(gè)抗原表位,用這些預(yù)測(cè)表位序列設(shè)計(jì)組合成四個(gè)嵌合基因SSCV-A、SSCV-B、SSCV-C、SSCV-D。人工合成后插入pGEX-6p-1的BamHI和XhoI位點(diǎn)間,構(gòu)建成融合表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白。經(jīng)免疫印跡試驗(yàn)表明嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物可被SARS康復(fù)患者血清所識(shí)別,表明重組融合蛋白具有免疫反應(yīng)性,提示預(yù)測(cè)表位中含有SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位。用純化的重組融合蛋白GST-SSCV-D和GST-SSCV-A為抗原制備了一系列單克隆抗體�？筍SCV-D的單抗有兩株,分別為D3D1和D3C5。將6個(gè)S蛋白預(yù)測(cè)表位分別與GST融合表達(dá)。在這6個(gè)融合蛋白中,GST-S5可以和單克隆抗體D3C5反應(yīng),GST-S2可以和單抗D3D1反應(yīng)。Western blot分析表明兩個(gè)單抗所識(shí)別的表位均為線性表位。兩個(gè)表位分別位于SARS-CoV纖突蛋白的第447至458氨基酸殘基和789至799氨基酸殘基。D3D1表位(447～458)正位于S蛋白與受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域中。 2C5是一株SARS-CoV S蛋白特異的有中和活性的單克隆抗體。以2C5為篩選靶分子,篩選噬菌體展示隨機(jī)7肽庫(kù)。經(jīng)三輪淘洗后隨機(jī)挑選20個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行ELISA分析和序列測(cè)定。在10個(gè)ELISA OD值大于0.2的陽(yáng)性噬菌體克隆中,有8個(gè)噬菌體克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有該序列的噬菌體克隆能競(jìng)爭(zhēng)抑制SARS-CoV S蛋白抗原與單抗2C5的結(jié)合。與SARS-CoV S蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)該7肽序列散布于S蛋白的第539位到第559位氨基酸上。將S蛋白T_(539)PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT_(559)的21肽與GST進(jìn)行融合表達(dá),得到了可溶解的融合蛋白。該融合蛋白能不能被單抗2C5識(shí)別,但經(jīng)Western blot分析表明該融合蛋白能被滅活SARS冠狀病毒免疫雞血清識(shí)別。表明T_(539)PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT_(559)是S蛋白的一個(gè)線性表位,而TPEQQFT為單克隆抗體2C5的模擬表位。 SARS冠狀病毒S蛋白在病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合、細(xì)胞膜融合及入侵、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體中起重要作用。S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核心區(qū)域?yàn)?18～510片段�？寺〔⑷诤媳磉_(dá)了S蛋白318～510片段,分析表明原核表達(dá)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白能被SARS康復(fù)患者清和高免動(dòng)物血清所識(shí)別。進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一套23個(gè)覆蓋整個(gè)該受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)為16氨基酸殘基的部分重疊的短肽,并進(jìn)行了融合表達(dá)。用23個(gè)融合蛋白對(duì)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行抗原表位作圖。結(jié)果鑒定出兩個(gè)抗原表位SRBD3(F_(334)PSVYAWERKKISNCV_(349))和表位D3D1(K_(447)LRPFERDI_(455))。 SARS冠狀病毒S蛋白S1部分在與細(xì)胞受體結(jié)合以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體中發(fā)揮重要作用。用PCR擴(kuò)增S1(12～672)及S1N(12～510),S1C(318～672)和SRBD(318～510)四個(gè)片段。PCR產(chǎn)物分別克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1中,經(jīng)誘導(dǎo)各融合蛋白均以包涵體形式表達(dá)。Western
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1350937