本文關(guān)鍵詞：A型流感病毒不同亞型在A549細(xì)胞中增殖情況的研究　出處：《汕頭大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 背景及目的 A型流感病毒(influenza A virus，IAV)可引起廣泛的動(dòng)物感染，特別是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)能引起家禽類以急性致死性為主要特征的烈性傳染病，常導(dǎo)致全群覆滅，給養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊。IAV亞型眾多，且在流行中極易發(fā)生變異，它可在短期內(nèi)突然發(fā)生，起病急、蔓延快，往往造成不同程度的流行，甚至造成世界性大流行。故而WHO將流感作為第一個(gè)實(shí)行全球監(jiān)測(cè)的疾病。 進(jìn)入21世紀(jì)，禽流感似乎在全球愈演愈烈，使人類處于其危害的陰影之中。人類生存環(huán)境中大量存在著禽流感病毒，人類的生產(chǎn)生活活動(dòng)增加了感染禽流感的機(jī)會(huì)。因而流感病毒的監(jiān)測(cè)凸顯出愈來(lái)愈重要的地位和作用。流感監(jiān)測(cè)最主要的目的是為了及時(shí)發(fā)現(xiàn)并抓住有意義的流感病毒新變種，尤其是大流行株，用于診斷試劑的制備、疫苗的生產(chǎn)及疫情預(yù)報(bào)。流感病毒診斷中最重要的方法就是病毒的分離鑒定，目前國(guó)內(nèi)常規(guī)流感病毒檢測(cè)采用雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、血凝實(shí)驗(yàn)(Hemagglutination assay，HA)及血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination Inhibition test，HI test)確定型與亞型。近幾年，隨著禽流感的頻繁暴發(fā)以及跨種屬傳播的加劇，人們認(rèn)識(shí)到需要研究一種可在流感大流行時(shí)快速、大量生產(chǎn)流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。但報(bào)告的用于流感病毒接種和傳代的細(xì)胞系仍較少，能夠支持流感病毒復(fù)制增殖的原代細(xì)胞和連續(xù)細(xì)胞系數(shù)目是有限的。故進(jìn)一步尋找對(duì)流感病毒敏感的細(xì)胞具有重要意義。 流感病毒主要是通過(guò)血凝素(HA)與宿主細(xì)胞表面受體識(shí)別結(jié)合而粘著到細(xì)胞表面，進(jìn)而入侵細(xì)胞的。禽源性和人源性的流感病毒HA受體結(jié)合特點(diǎn)各有不同，從而決定了病毒的宿主范圍，人流感病毒傾向于結(jié)合NeuAa-2,6-Gal(2-去氧-N-乙�；窠�(jīng)氨酸-6-半乳糖)受體，禽流感病毒則傾向于結(jié)合NeuAa-2,3-Gal(2-去氧-N-乙�；窠�(jīng)氨酸-3-半乳糖)受體。一般認(rèn)為禽流感病毒會(huì)較穩(wěn)定的存在于野禽類，但是近幾年來(lái)禽類病毒不斷使家禽類受到大面積感染，甚至打破種屬屏障引起人或其他哺乳動(dòng)物感染，且有些病例提示人——人傳播的可能性已經(jīng)存在。由此可見(jiàn)，為了更加適應(yīng)新的宿主——人，病毒在各方面不斷發(fā)生變化。搞清這些流感病毒的變異和病毒如何選擇物種以及如何跨越物種而流行的分子機(jī)制，對(duì)預(yù)防和控制新型流感的爆發(fā)是非常重要的。 本實(shí)驗(yàn)選用來(lái)源于人肺泡Ⅱ型上皮，穩(wěn)定傳代的連續(xù)細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞作為研究對(duì)象。接種不同亞型的A型流感病毒，使用血清學(xué)試驗(yàn)和病毒定量試驗(yàn)，檢測(cè)病毒的毒力及在細(xì)胞中的增殖能力，與目前常用流感病毒分離鑒定細(xì)胞系MDCK(Madin-Darby canine kidney)細(xì)胞進(jìn)行比較，看A549細(xì)胞是否適合作為流感病毒分離鑒定細(xì)胞系。此外，，通過(guò)定性研究的方法，檢測(cè)A549細(xì)胞中NeuAa-2，3-Gal、NeuAa-2,6-Gal兩種受體的分布情況，分析A549細(xì)胞是否可以為流感病毒跨種屬傳播的研究提供更好的細(xì)胞模型。 材料和方法 選取本實(shí)驗(yàn)室提供的7株A型流感病毒株，人類病毒2株(H1和H3亞型)，禽類病毒5株(H1、H3、H7、G1和G9亞型)，均已測(cè)序明確，依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取病毒株的原始血凝效價(jià)均較高，禽類病毒株大于512，人類病毒株大于128。將各亞型病毒株依據(jù)原始滴度按一定比例稀釋，分別接種于A549細(xì)胞和MDCK細(xì)胞后采用一系列病毒血清學(xué)和病毒定量試驗(yàn)，將兩者結(jié)果進(jìn)行比較分析。使用定性研究的方法，檢測(cè)A549細(xì)胞中的受體分布情況。①觀察病毒增殖各種指標(biāo)的變化，即不同時(shí)段倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)。病毒血清學(xué)試驗(yàn)，血凝試驗(yàn)檢測(cè)VGM中血凝活性，測(cè)定病毒的增殖感染能力；②空斑形成試驗(yàn)。計(jì)數(shù)不同稀釋度病毒形成的空斑數(shù)，以空斑形成單位(Plaque forming unit，PFU)表示病毒的感染滴度，檢測(cè)病毒在細(xì)胞中的增殖能力；③50％組織培養(yǎng)細(xì)胞感染劑量法(TCID50)，計(jì)算結(jié)果，測(cè)定病毒稀釋度，檢測(cè)細(xì)胞對(duì)于病毒的敏感程度；④使用生物素以及熒光標(biāo)記的植物性凝集素MAA和SNA，分別特異性針對(duì)NeuAa-2,3-Gal和NeuAa-2,6-Gal受體。染色后鏡下觀察A549細(xì)胞中兩種受體分布情況。 結(jié)果 1．各亞型A型流感病毒在A549細(xì)胞中培養(yǎng)至36小時(shí)血凝效價(jià)最高，同時(shí)可見(jiàn)明顯CPE。在MDCK細(xì)胞中培養(yǎng)至72小時(shí)血凝效價(jià)最高，出現(xiàn)明顯CPE的時(shí)段與HA效價(jià)最高時(shí)段基本相符，但是滴度均較原始滴度有不同程度的下降，這也驗(yàn)證了使用MDCK細(xì)胞，容易導(dǎo)致病毒滴度下降的說(shuō)法。A549細(xì)胞中HA滴度下降的更明顯，最高下降率可達(dá)98.3％，且禽類病毒下降率要高于人類病毒。 2．空斑形成試驗(yàn)結(jié)果。選擇MOI 0.1的H1N1亞型(DK／ST／1734／2003)流感病毒，依據(jù)公式：空斑形成單位(pfu／ml)=(每孔平均空斑數(shù)×病毒稀釋度)／每孔病毒接種量(ml)，計(jì)算結(jié)果。MDCK細(xì)胞中每孔接種1ml 10~(-6)的病毒液，平均空斑數(shù)75個(gè)，PFU=7.5×10~7。A549細(xì)胞中每孔接種1ml 10~(-4)的病毒液，平均空斑數(shù)12個(gè)，PFU=1.2×10~5。 3．TCID50結(jié)果。依據(jù)Karber公式log TCID50=L-d(s-0.5)計(jì)算。A549細(xì)胞中滴度T1=3×10~7TCID50／ml，MDCK細(xì)胞中滴度T2=4×10~9TCID50／ml。 4．A549細(xì)胞中受體分布情況。生物素標(biāo)記的MAA和SNA，鏡下可見(jiàn)MAA著色細(xì)胞明顯多于SNA著色細(xì)胞，說(shuō)明A549細(xì)胞中MAA結(jié)合的NeuAa-2,3-Gal受體要多于SNA結(jié)合的NeuAa-2,6-Gal受體。FITC標(biāo)記的MAA在熒光顯微鏡下發(fā)出黃綠色的熒光，TMRITC標(biāo)記的SNA鏡下發(fā)出橙紅色的熒光，結(jié)果顯示黃綠色熒光略強(qiáng)于橙紅色熒光，但是差異不明顯。 結(jié)論 1．病毒感染后的A549細(xì)胞維持液中的病毒效價(jià)明顯降低，雖然能出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，但不能在該細(xì)胞內(nèi)有效的增殖復(fù)制。A549細(xì)胞對(duì)于流感病毒是中低度敏感細(xì)胞。 2．A549細(xì)胞中每接種1ml病毒液病毒做10~(-5)的稀釋可以形成空斑，而MDCK細(xì)胞中接種等量病毒形成空斑，需要稀釋10~(-7)。同一株病毒在MDCK細(xì)胞中的增殖能力要強(qiáng)于A549細(xì)胞。 3．A549細(xì)胞中病毒接種所需稀釋度要高于MDCK細(xì)胞，說(shuō)明同一株病毒在MDCK細(xì)胞中增殖的能力要強(qiáng)于A549細(xì)胞。 4．A549細(xì)胞中NeuAa-2,3-Gal受體占多數(shù)，明顯多于NeuAa-2,6-Gal受體，主要是以禽類病毒結(jié)合的受體為主。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1350339