發(fā)布時間：2017-12-29 12:32

  本文關鍵詞：A型流感病毒不同亞型在A549細胞中增殖情況的研究　出處：《汕頭大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 背景及目的 A型流感病毒(influenza A virus，IAV)可引起廣泛的動物感染，特別是禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)能引起家禽類以急性致死性為主要特征的烈性傳染病，常導致全群覆滅，給養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊。IAV亞型眾多，且在流行中極易發(fā)生變異，它可在短期內突然發(fā)生，起病急、蔓延快，往往造成不同程度的流行，甚至造成世界性大流行。故而WHO將流感作為第一個實行全球監(jiān)測的疾病。 進入21世紀，禽流感似乎在全球愈演愈烈，使人類處于其危害的陰影之中。人類生存環(huán)境中大量存在著禽流感病毒，人類的生產生活活動增加了感染禽流感的機會。因而流感病毒的監(jiān)測凸顯出愈來愈重要的地位和作用。流感監(jiān)測最主要的目的是為了及時發(fā)現并抓住有意義的流感病毒新變種，尤其是大流行株，用于診斷試劑的制備、疫苗的生產及疫情預報。流感病毒診斷中最重要的方法就是病毒的分離鑒定，目前國內常規(guī)流感病毒檢測采用雞胚、細胞培養(yǎng)分離病毒、血凝實驗(Hemagglutination assay，HA)及血凝抑制試驗(Hemagglutination Inhibition test，HI test)確定型與亞型。近幾年，隨著禽流感的頻繁暴發(fā)以及跨種屬傳播的加劇，人們認識到需要研究一種可在流感大流行時快速、大量生產流感病毒的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。但報告的用于流感病毒接種和傳代的細胞系仍較少，能夠支持流感病毒復制增殖的原代細胞和連續(xù)細胞系數目是有限的。故進一步尋找對流感病毒敏感的細胞具有重要意義。 流感病毒主要是通過血凝素(HA)與宿主細胞表面受體識別結合而粘著到細胞表面，進而入侵細胞的。禽源性和人源性的流感病毒HA受體結合特點各有不同，從而決定了病毒的宿主范圍，人流感病毒傾向于結合NeuAa-2,6-Gal(2-去氧-N-乙�；窠洶彼�-6-半乳糖)受體，禽流感病毒則傾向于結合NeuAa-2,3-Gal(2-去氧-N-乙�；窠洶彼�-3-半乳糖)受體。一般認為禽流感病毒會較穩(wěn)定的存在于野禽類，但是近幾年來禽類病毒不斷使家禽類受到大面積感染，甚至打破種屬屏障引起人或其他哺乳動物感染，且有些病例提示人——人傳播的可能性已經存在。由此可見，為了更加適應新的宿主——人，病毒在各方面不斷發(fā)生變化。搞清這些流感病毒的變異和病毒如何選擇物種以及如何跨越物種而流行的分子機制，對預防和控制新型流感的爆發(fā)是非常重要的。 本實驗選用來源于人肺泡Ⅱ型上皮，穩(wěn)定傳代的連續(xù)細胞系A549細胞作為研究對象。接種不同亞型的A型流感病毒，使用血清學試驗和病毒定量試驗，檢測病毒的毒力及在細胞中的增殖能力，與目前常用流感病毒分離鑒定細胞系MDCK(Madin-Darby canine kidney)細胞進行比較，看A549細胞是否適合作為流感病毒分離鑒定細胞系。此外，，通過定性研究的方法，檢測A549細胞中NeuAa-2，3-Gal、NeuAa-2,6-Gal兩種受體的分布情況，分析A549細胞是否可以為流感病毒跨種屬傳播的研究提供更好的細胞模型。 材料和方法 選取本實驗室提供的7株A型流感病毒株，人類病毒2株(H1和H3亞型)，禽類病毒5株(H1、H3、H7、G1和G9亞型)，均已測序明確，依據預試驗結果，選取病毒株的原始血凝效價均較高，禽類病毒株大于512，人類病毒株大于128。將各亞型病毒株依據原始滴度按一定比例稀釋，分別接種于A549細胞和MDCK細胞后采用一系列病毒血清學和病毒定量試驗，將兩者結果進行比較分析。使用定性研究的方法，檢測A549細胞中的受體分布情況。①觀察病毒增殖各種指標的變化，即不同時段倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(Cytopathic effect，CPE)。病毒血清學試驗，血凝試驗檢測VGM中血凝活性，測定病毒的增殖感染能力；②空斑形成試驗。計數不同稀釋度病毒形成的空斑數，以空斑形成單位(Plaque forming unit，PFU)表示病毒的感染滴度，檢測病毒在細胞中的增殖能力；③50％組織培養(yǎng)細胞感染劑量法(TCID50)，計算結果，測定病毒稀釋度，檢測細胞對于病毒的敏感程度；④使用生物素以及熒光標記的植物性凝集素MAA和SNA，分別特異性針對NeuAa-2,3-Gal和NeuAa-2,6-Gal受體。染色后鏡下觀察A549細胞中兩種受體分布情況。 結果 1．各亞型A型流感病毒在A549細胞中培養(yǎng)至36小時血凝效價最高，同時可見明顯CPE。在MDCK細胞中培養(yǎng)至72小時血凝效價最高，出現明顯CPE的時段與HA效價最高時段基本相符，但是滴度均較原始滴度有不同程度的下降，這也驗證了使用MDCK細胞，容易導致病毒滴度下降的說法。A549細胞中HA滴度下降的更明顯，最高下降率可達98.3％，且禽類病毒下降率要高于人類病毒。 2．空斑形成試驗結果。選擇MOI 0.1的H1N1亞型(DK／ST／1734／2003)流感病毒，依據公式：空斑形成單位(pfu／ml)=(每孔平均空斑數×病毒稀釋度)／每孔病毒接種量(ml)，計算結果。MDCK細胞中每孔接種1ml 10~(-6)的病毒液，平均空斑數75個，PFU=7.5×10~7。A549細胞中每孔接種1ml 10~(-4)的病毒液，平均空斑數12個，PFU=1.2×10~5。 3．TCID50結果。依據Karber公式log TCID50=L-d(s-0.5)計算。A549細胞中滴度T1=3×10~7TCID50／ml，MDCK細胞中滴度T2=4×10~9TCID50／ml。 4．A549細胞中受體分布情況。生物素標記的MAA和SNA，鏡下可見MAA著色細胞明顯多于SNA著色細胞，說明A549細胞中MAA結合的NeuAa-2,3-Gal受體要多于SNA結合的NeuAa-2,6-Gal受體。FITC標記的MAA在熒光顯微鏡下發(fā)出黃綠色的熒光，TMRITC標記的SNA鏡下發(fā)出橙紅色的熒光，結果顯示黃綠色熒光略強于橙紅色熒光，但是差異不明顯。 結論 1．病毒感染后的A549細胞維持液中的病毒效價明顯降低，雖然能出現明顯細胞病變，但不能在該細胞內有效的增殖復制。A549細胞對于流感病毒是中低度敏感細胞。 2．A549細胞中每接種1ml病毒液病毒做10~(-5)的稀釋可以形成空斑，而MDCK細胞中接種等量病毒形成空斑，需要稀釋10~(-7)。同一株病毒在MDCK細胞中的增殖能力要強于A549細胞。 3．A549細胞中病毒接種所需稀釋度要高于MDCK細胞，說明同一株病毒在MDCK細胞中增殖的能力要強于A549細胞。 4．A549細胞中NeuAa-2,3-Gal受體占多數，明顯多于NeuAa-2,6-Gal受體，主要是以禽類病毒結合的受體為主。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：汕頭大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R373

【參考文獻】

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2 郭元吉,李建國,程小雯,王敏,鄒毅,李釧華,蔡訪潺,廖華樂,張燁,郭俊峰,黃瑞敏,貝東;禽H9N2亞型流感病毒能感染人的發(fā)現[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;1999年02期

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本文編號：1350339