發(fā)布時(shí)間：2017-12-28 22:33

  本文關(guān)鍵詞：補(bǔ)體攻膜復(fù)合物C5b-9對人外周血單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞分化成熟及免疫學(xué)功能的影響　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 補(bǔ)體(complement)系統(tǒng)作為天然免疫(innate immunity)中的一類重要和保守的體系,當(dāng)病原微生物或炎癥介質(zhì)存在時(shí)可被激活最終通過末端成分組裝成C5b-9膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex,MAC),為機(jī)體提供了快速和高效的清除入侵微生物的途徑。MAC是一種多效免疫因子,在補(bǔ)體大量活化后,可插入細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞溶破死亡,而近年來通過對MAC與有核細(xì)胞相互作用的研究,這一觀點(diǎn)已發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)證明:有核細(xì)胞能通過囊泡化或內(nèi)吞作用,清除沉積于細(xì)胞膜上的MAC,保護(hù)自身免遭補(bǔ)體溶破,此時(shí)的MAC稱為亞溶破MAC ( sublytic MAC, sMAC )。體外的研究也證實(shí),亞溶破劑量的MAC對多種有核細(xì)胞具有刺激和活化作用。近來新的研究發(fā)現(xiàn),非致死劑量的MAC可沉積于中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞等多種有核細(xì)胞,刺激細(xì)胞發(fā)生多種代謝改變,包括分泌氧自由基、類脂質(zhì)等炎癥介質(zhì),并誘導(dǎo)細(xì)胞因子、黏附分子以及其他功能蛋白的表達(dá)等。補(bǔ)體系統(tǒng)除了補(bǔ)體的直接殺傷機(jī)制外,在補(bǔ)體活化過程中釋放的多種小片斷分子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),包括趨化中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、調(diào)理吞噬、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答等等。因此,補(bǔ)體是連接機(jī)體天然免疫和獲得性免疫(adaptive immunity)的“橋梁”。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC),能高效的攝取、加工處理和提呈抗原,具有較強(qiáng)的遷移能力,并能顯著地激活初始型T細(xì)胞以啟動T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng),在免疫應(yīng)答中處于中心調(diào)控地位。此外,DC與B細(xì)胞以及NK細(xì)胞等也存在著相互作用,可見,DC在連接天然免疫和獲得性免疫之間起著非常重要的作用。DC是一類異質(zhì)性的細(xì)胞群體,不同的亞群,不同的成熟狀態(tài),其免疫學(xué)功能特點(diǎn)不同,在免疫應(yīng)答與免疫耐受、抗腫瘤、抗感染免疫中發(fā)揮不同的作用。多種外源或內(nèi)源因素均可調(diào)節(jié)DC的分化發(fā)育,刺激其成熟以及免疫學(xué)功能。但到目前為止,還未見補(bǔ)體攻膜復(fù)合物C5b-9與樹突狀細(xì)胞相互作用,特別是補(bǔ)體C5b-9是否影響樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育成熟已經(jīng)免疫學(xué)功能的相關(guān)報(bào)道。 有研究顯示,血液中樹突狀細(xì)胞表面有補(bǔ)體攻膜復(fù)合物C5b-9沉積,甚至在培養(yǎng)幾天后還能檢測到,且樹突狀細(xì)胞的活力也未受影響,在人的濾泡樹突狀細(xì)胞所處的淋巴細(xì)胞生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體攻膜復(fù)合物。既然補(bǔ)體和DC均能夠連接天然免疫和獲得性免疫,且在DC的表面又有C5b-9的沉積,因此我們推測,補(bǔ)體有可能通過調(diào)節(jié)DC分化發(fā)育成熟以及免疫學(xué)功能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。為證實(shí)這一設(shè)想,我們設(shè)計(jì)并進(jìn)行了本研究。本研究的完成有助于在免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制方面獲得新的認(rèn)識,并對補(bǔ)體和DC之間在連接天然免疫和獲得性免疫之間的作用及相互關(guān)系能有更全面的了解,為進(jìn)一步從新的角度和思路深入研究DC在抗原特異性免疫應(yīng)答與免疫耐受中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 為明確亞溶破C5b-9(sublytic C5b-9, sC5b-9)對樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育影響,本研究共分三部分: 第一部分,外周血單核來源樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)。選取38例健康志愿者外周血白膜,Ficoll密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞( peripheral blood mononuclear cell,PBMC),貼壁法分離純化獲得較純的單核細(xì)胞(monocyte),在GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(25ng/ml)聯(lián)合作用下誘導(dǎo)分化為未成熟樹突狀細(xì)胞(immaure dendritic cell, imDC),于誘導(dǎo)的第5d,通過鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以及流式檢測表面標(biāo)志,結(jié)果顯示,貼壁后CD14+單核細(xì)胞百分率達(dá)87%以上,rhGM-CSF+rhIL-4誘導(dǎo)后,細(xì)胞CD1a表達(dá)上調(diào),CD14表達(dá)下降,說明誘導(dǎo)所獲細(xì)胞未典型imDC,建立了穩(wěn)定的體外DC培養(yǎng)體系。 第二部分,建立體外DC亞溶破模型。利用C5b6、C7、C8、C9補(bǔ)體蛋白純品,imDC膜表面組裝C5b-9,觀察細(xì)胞的狀態(tài),激光共聚焦檢測C5b-9在imDC膜上的組裝情況,流式檢測組裝C5b-9后DC的凋亡情況,LDH釋放檢測C5b-9對DC的溶破效應(yīng)。結(jié)果顯示,C5b-9在imDC膜上組裝成功,當(dāng)C5b6濃度小于0.8μg/ml時(shí),C5b-9對DC膜的完整性沒有影響,但當(dāng)大于0.8μg/ml時(shí),膜完整性隨著C5b6濃度的增加破壞加劇,因此確定了C5b-9對DC的體外亞溶破劑量為用小于0.8μg/ml C5b6,10μg/ml C7,10μg/ml C8,10μg/ml C9組裝的C5b-9,成功建立體外DC亞溶破模型。 第三部分,sC5b-9對imDC成熟以及免疫學(xué)功能的影響。imDC膜上組裝sC5b-9,刺激3d后,流式檢測細(xì)胞表面的成熟分化標(biāo)志,HLA相關(guān)抗原以及共刺激分子的表達(dá);流式分析抗原捕獲能力以及抗原捕獲相關(guān)分子;ELISA檢測sC5b-9處理DC細(xì)胞因子分泌情況;與同種異體CD4~+T、CD8~+T或CD4~+CD45RA~+T細(xì)胞共培養(yǎng),通過流式分析DC刺激的CD4+T、CD8~+T等表面活化標(biāo)志、ELISA檢測CD4~+T、CD8~+T或CD4~+CD45RA~+T細(xì)胞因子分泌情況,明確DC激活T細(xì)胞的能力。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)LPS(1μg/ml)、C5b-8,C5b-7,C5b6,C7,C8,C9同時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:與未刺激組相比,sC5b-9處理DC表面分化標(biāo)志CD14及CD1a變化不顯著,成熟標(biāo)志CD83、HLA相關(guān)抗原、共刺激分子CD80、CD86、B7-H1、B7-H3、B7-H4、BTLA等表達(dá)上調(diào);sC5b-9處理DC分泌IL-12及TNF-α上調(diào),抗原捕獲能力及抗原捕獲相關(guān)分子降低;sC5b-9處理DC刺激CD4~+T活化及分泌IFN-γ、IL-2能力增強(qiáng),IL-10變化不顯著,但sC5b-9處理DC刺激CD8~+T活化及分泌IFN-γ、IL-2、IL-10均不顯著;sC5b-9處理DC與CD4~+CD45RA~+T共培養(yǎng)后檢測細(xì)胞因子分泌,發(fā)現(xiàn)CD4~+CD45RA~+T分泌IL-4降低而IFN-γ增加。以上結(jié)果表明,sC5b-9促進(jìn)的DC成熟,誘導(dǎo)了Th1極化。 通過以上三部分的研究,我們得出如下結(jié)論: 直接貼壁法能獲得相對較純的單核細(xì)胞,利用rhGM-CSF聯(lián)合rhIL-4貼壁的單核細(xì)胞,隔日半量補(bǔ)充細(xì)胞因子,在第5d能獲得典型的imDC。 利用補(bǔ)體蛋白純品C5b6、C7、C8、C9在合適條件下能體外于imDC膜表面組裝C5b-9,當(dāng)補(bǔ)體純品C5b6濃度小于0.8ug/mL時(shí),組裝的C5b-9為亞溶破型。 sC5b-9能促進(jìn)imDC向成熟DC轉(zhuǎn)變,同時(shí)抗原捕獲能力降低,IL-12和TNF-α分泌上調(diào);sC5b-9處理DC同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力增加,激活CD4~+T細(xì)胞能力提高并誘導(dǎo)初始T細(xì)胞Th1極化。 綜上所述,作為天然免疫重要組成部分的補(bǔ)體系統(tǒng),除了能夠直接殺傷入侵的病原微生物外,還可以通過在活化形成的攻膜復(fù)合物C5b-9調(diào)控機(jī)體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞—DC的成熟以及免疫學(xué)功能,從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。上述研究結(jié)果對于深入認(rèn)識天然免疫和獲得性免疫之間的作用以及相互關(guān)系,探討獲得性免疫的啟動以及維持自身免疫耐受的機(jī)制等提供了實(shí)驗(yàn)線索。
[Abstract]:Complement (complement) system as a natural immune (innate immunity) is a kind of important and conserved system, in the presence of pathogenic microorganisms or inflammatory mediators can be activated by the end of the final components assembled into C5b-9 membrane attack complex (membrane attack, complex, MAC), provides a rapid and efficient way for eliminating microbes the body. MAC is a multipotent immune factor. After a large number of complement activation, it can be inserted into the cell membrane, resulting in cell lysis and death. In recent years, the idea of interaction between MAC and nucleated cells has changed. Experiments show that nucleated cells can remove MAC deposited on the cell membrane through vesicle or endocytosis, protect itself from complement dissolution, and MAC is called MAC sublytic (sMAC). In vitro studies have also demonstrated that subsoluble MAC can stimulate and activate a variety of nucleated cells. Recently, a new study found that non lethal doses of MAC can be deposited on neutrophils, monocytes and other kinds of nucleated cells, stimulate cell metabolism occurred in a variety of changes, including the release of oxygen free radicals, lipid and other inflammatory mediators, and induce the expression of cytokines and adhesion molecules expression and other functional protein etc.. In addition to the direct killing mechanism of complement, complement molecules, including many small fragments released during complement activation, have a wide range of biological effects, including chemotaxis, neutrophils and lymphocytes, regulating phagocytosis, and participating in regulating cellular and humoral immune responses. Therefore, the complement is a "bridge" connecting the natural immune and acquired immune (adaptive immunity) of the body.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1347734