本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒rAdCDglyTK的構(gòu)建和體內(nèi)、外抑殺瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 惡性腫瘤 自殺基因 胞嘧啶脫氨酶 胸苷激酶 融合基因 重組腺病毒

【摘要】： 通過自殺基因輔以前體藥物進(jìn)行惡性腫瘤治療是近年來基礎(chǔ)、臨床相關(guān)醫(yī)務(wù)人員研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。本研究所選用課題組前期制備的含大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(EC-CD)基因和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重組腺病毒質(zhì)粒rpAdCDglyTK，于293細(xì)胞內(nèi)包裝、擴(kuò)增得到rAdCDglyTK。通過對(duì)融合自殺基因重組腺病毒rAdCDglyTK體內(nèi)、外抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究，比較單、融合自殺基因的抑瘤效果，為融合自殺基因rAdCDglyTK的臨床應(yīng)用積累的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究首先將課題組前期構(gòu)建成功的rpAdCDglyTK的重組腺病毒質(zhì)粒線性化，并用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞內(nèi)包裝，借助報(bào)告基因GFP表達(dá)綠色熒光蛋白以及PCR法擴(kuò)增感染細(xì)胞上清液得到特異性CDglyTK條帶顯示包裝成功。后經(jīng)傳代感染擴(kuò)增，CsCl密度梯度離心，純化得到高濃度的含融合自殺基因的重組腺病毒rAdCDglyTK，用TCID_(50)法確定其滴度。通過對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)分別證明了融合自殺基因重組腺病毒rAdCDglyTK中的CD基因和TK基因具有各自的功能活性，與單自殺基因重組腺病毒rAdCD和重組腺病毒rAdTK活性沒有顯著差異(P＞0.05)。 為了探討融合自殺基因重組腺病毒rAdCDglyTK的體外抑殺瘤作用，將重組腺病毒rAdCDglyTK／5-FC+ACV、課題組前期成功構(gòu)建的rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV及rAdlacZ／5-FC+ACV系統(tǒng)分別作用于人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肺癌細(xì)胞A549、人卵巢腺瘤SK-OV-3和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251。經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后，用MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，并與rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV、5-FC+ACV系統(tǒng)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建的重組腺病毒rAdCDglyTK對(duì)上述五種腫瘤細(xì)胞抑制作用為(54-79％)，與rAdCD／5-FC(30-46％)、rAdTK／ACV(31-45％)、rAdlacZ／5-FC+ACV(4-11％)系統(tǒng)相比均存在顯著性差異(P＜0.05)。與正常腫瘤細(xì)胞對(duì)照亦存在顯著性差異(P＜0.05)。 同時(shí)探討了重組腺病毒rAdCDglyTK的體外旁殺傷作用，將rAdCDglyTK與rAdCD、rAdTK、rAdlacZ系統(tǒng)分別感染人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肺癌細(xì)胞A549、人卵巢腺瘤SK-OV-3和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251。經(jīng)37℃5％CO_2孵箱培養(yǎng)12小時(shí)，收獲細(xì)胞后，將五種感染細(xì)胞分別與相應(yīng)的未感染細(xì)胞以不同比例混合，在同樣條件下再培養(yǎng)48小時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rAdCDglyTK系統(tǒng)在各混合比例感染組中抑殺瘤率均高于rAdCD、rAdTK、rAdlacZ系統(tǒng)，在感染比例低時(shí)(10％、25％)旁殺傷效果更為明顯(P＜0.05)，，隨著混合比例升高(75％)，rAdCDglyTK與rAdCD、rAdTK間不存在明顯差異(P＞0.05)。 為了探討構(gòu)建的重組腺病毒rAdCDglyTK的體內(nèi)抑殺瘤作用，本研究將Lewis肺癌株接種到C57BL近交純系小鼠左側(cè)腓腸肌，并按照方案給予rAdCDglyTK、rAdCD、rAdTK、rAdlacZ病毒及對(duì)應(yīng)前體藥物治療。通過觀測(cè)瘤體大小、重量、中位生存期及病理學(xué)改變等，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組(給予rAdCDglyTK／5-FC+ACV)小鼠瘤體平均生長(zhǎng)速度、瘤重明顯低于荷瘤對(duì)照組rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV、rAdlacZ／5-FC+ACV(P＜0.05)。小鼠腫瘤組織病理切片顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤組織壞死呈點(diǎn)灶狀，而對(duì)照組腫瘤組織則出現(xiàn)大面積壞死，從而也證明了rAdCDglyTK較單獨(dú)rAdCD、rAdTK有更好的體內(nèi)抑瘤效果。 本研究通過對(duì)重組腺病毒rAdCDglyTK體內(nèi)、外抑殺瘤作用實(shí)驗(yàn)研究，探討了rAdCDglyTK／5-FC+ACV系統(tǒng)有最佳殺抑腫瘤作用，此結(jié)果為今后臨床應(yīng)用自殺基因?qū)δ[瘤進(jìn)行基因治療奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:The treatment of malignant tumors by using suicide gene with precursor drugs is one of the hotspots in the research of basic and clinical related medical staff in recent years. In this study, we selected the recombinant adenovirus plasmid rpAdCDglyTK containing Escherichia coli cytosine deaminase (EC-CD) gene and herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene in the research group, and rAdCDglyTK was packaged and amplified in 293 cells. The anti-tumor effect of recombinant adenovirus rAdCDglyTK, a fusion suicide gene, was compared in vivo and in vitro. The anti-tumor effect of single and fusion suicide gene was compared, so as to accumulate experimental evidence for the fusion of suicide gene rAdCDglyTK.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R373;R346;R73-36

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本文編號(hào)：1347086