本文關鍵詞：重組腺病毒rAdCDglyTK的構建和體內、外抑殺瘤作用的實驗研究　出處：《天津醫(yī)科大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 通過自殺基因輔以前體藥物進行惡性腫瘤治療是近年來基礎、臨床相關醫(yī)務人員研究的熱點領域之一。本研究所選用課題組前期制備的含大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(EC-CD)基因和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重組腺病毒質粒rpAdCDglyTK，于293細胞內包裝、擴增得到rAdCDglyTK。通過對融合自殺基因重組腺病毒rAdCDglyTK體內、外抑瘤作用的實驗研究，比較單、融合自殺基因的抑瘤效果，為融合自殺基因rAdCDglyTK的臨床應用積累的實驗依據(jù)。 本研究首先將課題組前期構建成功的rpAdCDglyTK的重組腺病毒質粒線性化，并用脂質體法將其轉染至293細胞內包裝，借助報告基因GFP表達綠色熒光蛋白以及PCR法擴增感染細胞上清液得到特異性CDglyTK條帶顯示包裝成功。后經(jīng)傳代感染擴增，CsCl密度梯度離心，純化得到高濃度的含融合自殺基因的重組腺病毒rAdCDglyTK，用TCID_(50)法確定其滴度。通過對Hela腫瘤細胞的生長抑制實驗分別證明了融合自殺基因重組腺病毒rAdCDglyTK中的CD基因和TK基因具有各自的功能活性，與單自殺基因重組腺病毒rAdCD和重組腺病毒rAdTK活性沒有顯著差異(P＞0.05)。 為了探討融合自殺基因重組腺病毒rAdCDglyTK的體外抑殺瘤作用，將重組腺病毒rAdCDglyTK／5-FC+ACV、課題組前期成功構建的rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV及rAdlacZ／5-FC+ACV系統(tǒng)分別作用于人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞SMMC-7721、人肺癌細胞A549、人卵巢腺瘤SK-OV-3和人神經(jīng)膠質瘤細胞U251。經(jīng)48小時培養(yǎng)后，用MTT法檢測腫瘤細胞的生長抑制率，并與rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV、5-FC+ACV系統(tǒng)進行了比較。結果顯示，本研究構建的重組腺病毒rAdCDglyTK對上述五種腫瘤細胞抑制作用為(54-79％)，與rAdCD／5-FC(30-46％)、rAdTK／ACV(31-45％)、rAdlacZ／5-FC+ACV(4-11％)系統(tǒng)相比均存在顯著性差異(P＜0.05)。與正常腫瘤細胞對照亦存在顯著性差異(P＜0.05)。 同時探討了重組腺病毒rAdCDglyTK的體外旁殺傷作用，將rAdCDglyTK與rAdCD、rAdTK、rAdlacZ系統(tǒng)分別感染人宮頸癌細胞Hela、人肝癌細胞SMMC-7721、人肺癌細胞A549、人卵巢腺瘤SK-OV-3和人神經(jīng)膠質瘤細胞U251。經(jīng)37℃5％CO_2孵箱培養(yǎng)12小時，收獲細胞后，將五種感染細胞分別與相應的未感染細胞以不同比例混合，在同樣條件下再培養(yǎng)48小時，結果發(fā)現(xiàn)，rAdCDglyTK系統(tǒng)在各混合比例感染組中抑殺瘤率均高于rAdCD、rAdTK、rAdlacZ系統(tǒng)，在感染比例低時(10％、25％)旁殺傷效果更為明顯(P＜0.05)，，隨著混合比例升高(75％)，rAdCDglyTK與rAdCD、rAdTK間不存在明顯差異(P＞0.05)。 為了探討構建的重組腺病毒rAdCDglyTK的體內抑殺瘤作用，本研究將Lewis肺癌株接種到C57BL近交純系小鼠左側腓腸肌，并按照方案給予rAdCDglyTK、rAdCD、rAdTK、rAdlacZ病毒及對應前體藥物治療。通過觀測瘤體大小、重量、中位生存期及病理學改變等，證實了實驗組(給予rAdCDglyTK／5-FC+ACV)小鼠瘤體平均生長速度、瘤重明顯低于荷瘤對照組rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV、rAdlacZ／5-FC+ACV(P＜0.05)。小鼠腫瘤組織病理切片顯示，實驗組小鼠腫瘤組織壞死呈點灶狀，而對照組腫瘤組織則出現(xiàn)大面積壞死，從而也證明了rAdCDglyTK較單獨rAdCD、rAdTK有更好的體內抑瘤效果。 本研究通過對重組腺病毒rAdCDglyTK體內、外抑殺瘤作用實驗研究，探討了rAdCDglyTK／5-FC+ACV系統(tǒng)有最佳殺抑腫瘤作用，此結果為今后臨床應用自殺基因對腫瘤進行基因治療奠定了堅實的實驗基礎。
[Abstract]:The treatment of malignant tumors by using suicide gene with precursor drugs is one of the hotspots in the research of basic and clinical related medical staff in recent years. In this study, we selected the recombinant adenovirus plasmid rpAdCDglyTK containing Escherichia coli cytosine deaminase (EC-CD) gene and herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene in the research group, and rAdCDglyTK was packaged and amplified in 293 cells. The anti-tumor effect of recombinant adenovirus rAdCDglyTK, a fusion suicide gene, was compared in vivo and in vitro. The anti-tumor effect of single and fusion suicide gene was compared, so as to accumulate experimental evidence for the fusion of suicide gene rAdCDglyTK.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R373;R346;R73-36

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