本文關(guān)鍵詞：免疫激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌對成骨細(xì)胞功能的影響　出處：《蘇州大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定及旁分泌功能檢測 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Marrow mesenchymal stem cells, MSCs）具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞等多譜系分化潛能。隨著研究的深入，MSCs的旁分泌作用及免疫抑制活性逐漸引起廣泛關(guān)注。在本研究中，我們首先使用IFN-γ和TNF-α聯(lián)合刺激MSCs，然后通過檢測MSCs條件培養(yǎng)基（MSC-CM）的生物活性因子的變化水平，來研究其旁分泌功能變化。 方法： （1）收集無其他合并癥的骨折患者骨髓，采用密度梯度離心法收集含有MSCs的低密度層，獲取原代MSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 （2）取第三代MSCs，在特定誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞，并通過特異性染色進(jìn)行鑒定。 （3）用炎癥因子IFN-γ和TNF-α免疫激活干細(xì)胞，制備BM-MSCs條件培養(yǎng)基（MSC-CM）。 （4）ELISA及CBA法分析BM-MSCs條件培養(yǎng)基（MSC-CM），檢測HGF，，VEGF和TGF-β含量及IL-2，IL-4，IL-6和IL-10含量變化。 結(jié)果： （1）我們收集了8例無其他合并癥的骨折患者骨髓，均培養(yǎng)出原代MSCs細(xì)胞，細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)排列呈螺旋狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞基本保持長梭形的形態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)檢測到細(xì)胞表達(dá)CD44、CD73、CD90而不表達(dá)CD34。 （2）通過茜素紅染色、油紅O染色、阿爾新藍(lán)染色分別檢測BM-MSCs成骨、成脂、成軟骨分化能力，我們觀察到茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)，油紅O染色的脂肪小滴，阿而新藍(lán)染成藍(lán)色的硫酸多聚糖。 （3）聯(lián)合使用炎癥因子IFN-γ和TNF-α預(yù)刺激BM-MSCs，條件培養(yǎng)基中IL-6,VEGF, HGF和TGF-β的含量顯著升高(p0.01)，但I(xiàn)L-2, IL-4和IL-10的含量沒有顯著變化(p0.05)。 結(jié)論： （1）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛，傳代以后純化度可達(dá)90%以上，傳至10代以上仍能保持固定的長梭形細(xì)胞形態(tài)。 （2）BM-MSCs具有很強(qiáng)的多向分化特性，可作為細(xì)胞工程中理想的種子細(xì)胞。 （3）IFN-γ和TNF-α預(yù)刺激干細(xì)胞后，BM-MSCs的旁分泌功能發(fā)生了顯著的變化，其分泌IL-6、VEGF、HGF和TGF-β的作用顯著加強(qiáng)。 第二部分免疫激活后BM-MSCs對成骨細(xì)胞功能的影響 目的：高能量損傷所致的難治性骨不連、骨缺損發(fā)生率較高，目前在治療上仍有較大的困難。骨折不愈合與骨斷端的成骨細(xì)胞數(shù)量和活性降低有關(guān)。我們前期的研究顯示，炎癥因子IFN-γ和TNF-α免疫激活MSCs后，其旁分泌功能發(fā)生了顯著的變化，其中IL-6、 VEGF、 HGF和TGF-β的分泌量明顯升高。在本研究中，我們用MSC條件培養(yǎng)基孵育成骨細(xì)胞來探索免疫激活后BM-MSCs的旁分泌對成骨細(xì)胞增殖、遷徙、分化及細(xì)胞骨架的影響 方法：用IFN-γ和TNF-α預(yù)刺激MSCs，制備MSC條件培養(yǎng)基（MSC-CM）培養(yǎng)成骨細(xì)胞（MG63）。CCK8法檢測MG63細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞劃痕法檢測MG63細(xì)胞遷徙能力；鬼筆環(huán)肽染色法檢測MG63細(xì)胞骨架；Real-time PCR法檢測ALP、COLI及OCN基因的表達(dá)量變化；免疫熒光法檢測OPN表達(dá)；茜素紅染色檢測其礦化能力。 結(jié)果：在IFN-γ和TNF-α聯(lián)合刺激的MSC條件培養(yǎng)基作用下，MG63細(xì)胞的增殖速度明顯加快；細(xì)胞劃痕結(jié)果示其遷徙能力顯著提高（p0.01）；誘導(dǎo)第4、7天后成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)量明顯增多(p0.05)；免疫熒光染色示聯(lián)合刺激組的OPN陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高；茜素紅染色示IFN-γ+TNF-α組的MSC-CM誘導(dǎo)MG63細(xì)胞21天后鈣結(jié)節(jié)形成更多，礦化沉積作用更強(qiáng)；鬼筆環(huán)肽染色顯示細(xì)胞骨架未受影響。 結(jié)論：經(jīng)免疫激活后的MSC的旁分泌作用可以顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、遷徙、分化和礦化能力，從多個(gè)階段加強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨能力，為臨床應(yīng)用MSC治療骨質(zhì)缺損指導(dǎo)了新方向。
[Abstract]:Separation and identification of bone marrow mesenchymal stem cells and detection of paracrine function in part one
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R683

【參考文獻(xiàn)】

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1 包岳豐;孫振中;顧三軍;殷渠東;;四肢骨折內(nèi)固定術(shù)后骨不連原因分析[J];中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志;2013年10期

本文編號：1345678