本文關(guān)鍵詞：利用熒光生物感受器研究p38MAPK的生物活性　出處：《生物技術(shù)》2014年06期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：[目的]觀察生理狀態(tài)下人骨肉瘤細(xì)胞中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPKs)被磷酸化的過程。[方法]先進(jìn)行ECFP-p38MAPK-Citrine(p38MAPK biosensor)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定,然后轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞24h后觀察轉(zhuǎn)染效率和融合蛋白表達(dá)情況。在熒光顯微鏡下,應(yīng)用Meta Flour FRET 4.6軟件測(cè)量轉(zhuǎn)化生長因子-β1刺激MG-63細(xì)胞前后p38MAPK biosensor的熒光能量共振轉(zhuǎn)移的變化情況。[結(jié)果]p38MAPK biosensor轉(zhuǎn)染效率達(dá)30%~40%,均勻分布在胞質(zhì)和胞核中。轉(zhuǎn)化生長因子-β1刺激MG-63細(xì)胞后,胞質(zhì)和胞核內(nèi)熒光能量共振轉(zhuǎn)移比值(Citrine/CFP)迅速增高,歷時(shí)約30min達(dá)到最大值。特異性p38MAPK抑制劑SB-203580與細(xì)胞共孵育后,FRET比值逐漸減小。[結(jié)論]應(yīng)用熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)使我們?cè)诨罴?xì)胞生理狀態(tài)下,實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)p38MAPK被磷酸化的時(shí)空信息。
[Abstract]:[Objective] to observe the phosphorylation of p38 mitogen activated protein kinase (p38 mitogen-activated protein kinases) in human osteosarcoma cells under physiological condition. [Methods] we first constructed and identified the expression vector of ECFP-p38MAPK-Citrine (p38MAPK biosensor) fusion protein, then transfected MG-63 cell 24h, and observed the transfection efficiency and fusion protein expression. Under fluorescence microscope, Meta Flour FRET 4.6 software was used to measure the change of p38MAPK biosensor fluorescence energy resonance transfer in MG-63 cells stimulated by TGF - beta 1. [results the transfection efficiency of]p38MAPK biosensor was 30%~40% and distributed evenly in the cytoplasm and nucleus. After the TGF - beta 1 stimulated MG-63 cells, the fluorescence energy resonance transfer ratio (Citrine/CFP) in the cytoplasm and nucleus increased rapidly, and reached the maximum value of about 30min. After the specific p38MAPK inhibitor SB-203580 was incubated with the cells, the ratio of FRET decreased gradually. [Conclusion] using the fluorescence energy resonance technique, we can dynamically monitor the spatio-temporal information of phosphorylation of p38MAPK in live cell physiological state.
【作者單位】： 新疆地方民族與地方病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科;石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨一科;
【基金】：石河子大學(xué)課題(“TGFβ作用活細(xì)胞及p38MAPK信號(hào)通路的時(shí)空成像研究”,No.ZRKX2010ZD02-3)資助
【分類號(hào)】：R3416
【正文快照】： 0引言絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的酶家族。這一家族包括了4個(gè)主要成員:c-jun氨基端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK5)和p38MAPK[1]。1993年Brewster[2]等首先發(fā)現(xiàn)p38MAPK是

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