發(fā)布時(shí)間：2017-12-27 18:28

  本文關(guān)鍵詞：福爾馬林致痛大鼠神經(jīng)元多巴胺-β-羥化酶表達(dá)變化及其調(diào)控機(jī)制　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 第一部分福爾馬林致痛大鼠模型NA能神經(jīng)元變化和AP-2α的表達(dá)變化與調(diào)控1 目的:觀察福爾馬林誘導(dǎo)疼痛模型大鼠的行為學(xué)反應(yīng)及其脊髓、籃斑(LC)、小腦浦肯野細(xì)胞(PC)中DBH和激活蛋白2-α(AP-2α)的表達(dá)變化,以探討在疼痛應(yīng)激狀態(tài)下,NA能神經(jīng)元的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛及其調(diào)控機(jī)制。并探討AP-2α對(duì)DBH和調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法: ①成年Wistar大鼠110只,隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組又分為1、6、24 h和3、7 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn),采用大鼠足底注射福爾馬林的方法,制作福爾馬林致痛大鼠模型,對(duì)照組則在相應(yīng)的部位注射等量的生理鹽水,分別于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取材; ②動(dòng)物足底注射后,立即肉眼觀察動(dòng)物的注射局部體表變化和行為學(xué)變化; ③應(yīng)用HE染色、尼氏染色、透射電鏡等方法,觀察模型鼠脊髓、LC、小腦PC等形態(tài)學(xué)改變; ④應(yīng)用免疫組化、免疫熒光雙標(biāo),檢測(cè)福爾馬林誘導(dǎo)致痛模型大鼠脊髓、LC、脊髓DBH和AP-2α的表達(dá)變化以及二者共存情況; ⑤Western blotting和RT-PCR檢測(cè)DBH/ AP-2α及其mRNA在脊髓的表達(dá)變化; ⑥計(jì)算機(jī)圖像分析等方法,測(cè)量相關(guān)的免疫組化染色強(qiáng)度的變化及陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的變化; ⑦利用相關(guān)的統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果: ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)變化:福爾馬林注射后,實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物出現(xiàn)了典型的兩期傷害表現(xiàn)行為,注射局部出現(xiàn)明顯紅腫等炎癥反應(yīng)。HE染色顯示,模型鼠脊髓、LC、小腦PC無(wú)明顯的形態(tài)學(xué)改變;尼氏染色顯示,注射福爾馬林后模型鼠脊髓、LC、小腦PC表現(xiàn)為神經(jīng)元內(nèi)尼氏體染色增強(qiáng)、數(shù)量增多,超微結(jié)構(gòu)顯示神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體數(shù)量增多,稍有擴(kuò)張。 ②DBH/ AP-2α在小腦的表達(dá)變化:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠小腦PC均對(duì)DBH/ AP-2α呈陽(yáng)性表達(dá)。同對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組PC內(nèi)DBH/ AP-2α染色強(qiáng)度有顯著性增強(qiáng)(P0.05),在福爾馬林注射后3 d時(shí)染色最強(qiáng),注射后7 d時(shí)染色強(qiáng)度有所降低,但仍比對(duì)照組強(qiáng)。DBH和AP-2α的染色強(qiáng)度具有明顯的相關(guān)性。免疫熒光雙重標(biāo)記顯示DBH和AP-2α在PC中共存。Western blotting結(jié)果證實(shí)了小腦內(nèi)DBH/ AP-2α具有和免疫組化相似的變化規(guī)律。 ③DBH/ AP-2α在LC的表達(dá)變化:正常組大鼠LC內(nèi)NA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較少,染色淺淡;福爾馬林疼痛模型大鼠LC內(nèi)NA能神經(jīng)元數(shù)量明顯增加,同時(shí)染色強(qiáng)度也明顯增強(qiáng),3 d時(shí)增加最為明顯,7 d時(shí)仍然較高。圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,模型鼠LC內(nèi)NA能神經(jīng)元的數(shù)量和染色強(qiáng)度較對(duì)照組明顯增高(P0.05);免疫組化結(jié)果表明,LC內(nèi)AP-2α染色強(qiáng)度也明顯增強(qiáng),與正常對(duì)照組相比較,具有顯著性差異(P0.05)。 ④DBH/ AP-2α及其mRNA在脊髓的表達(dá)變化:對(duì)照組動(dòng)物脊髓內(nèi)NA能神經(jīng)元主要分布于脊髓前角,模型鼠脊髓前角、中間帶和后角均出現(xiàn)了大量深染的DBH陽(yáng)性神經(jīng)元,3 d時(shí)達(dá)到高峰,至第7 d時(shí)DBH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)有所下降,但仍高于正常水平。圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,疼痛模型動(dòng)物脊髓內(nèi)DBH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和染色強(qiáng)度明顯增加,與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P0.05);Western blotting結(jié)果證實(shí)DBH不同時(shí)段的表達(dá)變化規(guī)律,與上述形態(tài)學(xué)變化一致;RT-PCR顯示了相似的結(jié)果。AP-2α的表達(dá)變化與DBH的表達(dá)變化規(guī)律具有顯著的相似性(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)顯示DBH和AP-2α共存于脊髓神經(jīng)元內(nèi)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: ①證實(shí)小腦PC有DBH表達(dá),首次觀察到在疼痛應(yīng)激狀態(tài)下,PC中DBH表達(dá)增強(qiáng)。這一結(jié)果提示,小腦PC參與了疼痛應(yīng)激狀態(tài)下,運(yùn)動(dòng)或者感覺(jué)的調(diào)節(jié); ②福爾馬林疼痛模型大鼠LC內(nèi)NA能陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多,免疫組化染色強(qiáng)度也在福爾馬林注射后明顯增多,提示LC的NA能神經(jīng)元參與了疼痛過(guò)程的調(diào)控; ③在疼痛等應(yīng)激狀態(tài)下,脊髓前角NA能神經(jīng)元內(nèi)DBH表達(dá)明顯增強(qiáng);在脊髓中間帶和后角,即非NA能神經(jīng)元功能區(qū)出現(xiàn)大量DBH陽(yáng)性神經(jīng)元,推測(cè)這些區(qū)域內(nèi)某些神經(jīng)元的化學(xué)性質(zhì)可能發(fā)生了改變,由非NA能神經(jīng)元轉(zhuǎn)化為NA能神經(jīng)元,提示神經(jīng)元具有化學(xué)可塑性; ④上述區(qū)域內(nèi)AP-2α表達(dá)隨著DBH表達(dá)增強(qiáng)而增加,且免疫雙標(biāo)顯示二者共存于同一神經(jīng)元中,提示AP-2α可能對(duì)DBH的活性具有調(diào)節(jié)作用。 第二部分NA和DBH抑制劑對(duì)福爾馬林致痛大鼠行為學(xué)及NA能神經(jīng)元的影響 目的:觀察鞘內(nèi)注射N(xiāo)A和DBH抑制劑(U-14624)后,對(duì)福爾馬林致痛大鼠行為學(xué)和脊髓內(nèi)NA能神經(jīng)元DBH表達(dá)變化的影響。 方法: ①健康成年Wistar大鼠66只,隨機(jī)分為U-14624組、NA組、NS組、PFA+NS組、PFA+U-14624組、PFA+NA組,共6組; ②利用大鼠鞘內(nèi)置管的方法,在大鼠鞘內(nèi)注射相應(yīng)的試劑(NS組、PFA+NS組注射N(xiāo)S,NA組、PFA+NA組注射N(xiāo)A,U-14624組、PFA+U-14624組注射U-14624); ③大鼠鞘內(nèi)注射后10 min,再制作福爾馬林疼痛模型(PFA+NS組、PFA+U-14624組、PFA+NA組),對(duì)照組動(dòng)物(U-14624組、NA組、NS組)足底注射等量的NS; ④福爾馬林足底注射后,立即觀察動(dòng)物的行為學(xué)變化和體表特征,利用甩尾實(shí)驗(yàn)測(cè)量動(dòng)物的基礎(chǔ)痛閾和行為學(xué)評(píng)分方法,并對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析; ⑤在福爾馬林注射后24 h取材,采用HE染色、尼氏染色以及透射電鏡等方法,觀察各組動(dòng)物脊髓腰段的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化; ⑥利用免疫組化和Western blotting、RT-PCR等方法,對(duì)DBH及其mRNA在脊髓的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè); ⑦利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)所獲得的圖像進(jìn)行分析,并用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果: ①動(dòng)物鞘內(nèi)給藥后,各組大鼠均未出現(xiàn)呼吸抑制、死亡以及后肢麻痹等脊髓損傷的表現(xiàn); ②福爾馬林足底注射后,大鼠產(chǎn)生典型的兩期性傷害表現(xiàn)行為; ③單獨(dú)鞘內(nèi)注射N(xiāo)A(NA組),對(duì)動(dòng)物的行為學(xué)沒(méi)有顯著性的影響(與NS組相比較)(P0.05),鞘內(nèi)注射N(xiāo)A后制作的福爾馬林疼痛模型(PFA+NA組),其行為學(xué)評(píng)分顯示,對(duì)動(dòng)物的第Ⅰ、Ⅱ期傷害表現(xiàn)行為均能產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛的作用(P0.05),且動(dòng)物疼痛敏感性降低(P0.05); ④單獨(dú)鞘內(nèi)注射U-14624,對(duì)動(dòng)物的行為學(xué)沒(méi)有顯著性的影響(與NS組相比較)(P0.05);鞘內(nèi)注射U-14624后制作的福爾馬林疼痛模型(PFA+U-14624組),與PFA+NS組相比較,其行為學(xué)評(píng)分顯示,對(duì)動(dòng)物的第Ⅰ期傷害表現(xiàn)行為沒(méi)有顯著性改變(P0.05),但對(duì)第Ⅱ期傷害表現(xiàn)行為能產(chǎn)生明顯鎮(zhèn)痛的作用(P0.05),但動(dòng)物疼痛敏感性降低(P0.05); ⑤鞘內(nèi)注射N(xiāo)A后制作福爾馬林致痛大鼠模型(PFA+NA組),24 h取材,免疫組化顯示,脊髓內(nèi)DBH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和染色強(qiáng)度比對(duì)照組動(dòng)物(NA組和NS組)明顯增多和增強(qiáng)(P0.05)。與PFA+NS組相比較,陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和染色強(qiáng)度均降低,且具有顯著性差異(P0.05); ⑥鞘內(nèi)注射U-14624后制作福爾馬林致痛大鼠模型(PFA+U-14624組),24 h取材,免疫組化顯示,脊髓內(nèi)DBH陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和染色強(qiáng)度比對(duì)照組動(dòng)物(U-14624組和NS組)明顯增多和增強(qiáng)(P0.05),但與PFA+NS組相比較,陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量和染色強(qiáng)度有少量的增加,無(wú)顯著性差異(P0.05); ⑦Western blotting和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也DBH及其mRNA的變化規(guī)律與免疫組化相似。 結(jié)論:大鼠鞘內(nèi)注射N(xiāo)A,對(duì)大鼠具有明顯的鎮(zhèn)痛作用,且對(duì)DBH酶具有明顯的負(fù)反饋抑制作用。而鞘內(nèi)注射DBH的抑制劑后,行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),對(duì)疼痛模型第Ⅰ期傷害表現(xiàn)行為沒(méi)有顯著性影響,但對(duì)疼痛模型動(dòng)物第Ⅱ期傷害表現(xiàn)行為具有顯著性的影響,表明U-14624對(duì)痛覺(jué)的影響不是直接作用,可能是通過(guò)抑制DBH活性后,進(jìn)而影響NA合成量的變化,再導(dǎo)致動(dòng)物行為學(xué)的變化,但該抑制劑對(duì)DBH的表達(dá)產(chǎn)量沒(méi)有明顯的影響。通過(guò)調(diào)節(jié)DBH的活性,可以影響動(dòng)物脊髓內(nèi)NA合成量發(fā)生變化,從而對(duì)脊髓水平的鎮(zhèn)痛進(jìn)行調(diào)節(jié),提示NA參與了脊髓水平痛覺(jué)的調(diào)制及鎮(zhèn)痛過(guò)程。 第三部分NA和DBH抑制劑對(duì)PC和脊髓前角細(xì)胞電生理的影響 目的:研究NA和DBH抑制劑(1-Phenyl-3 -(2-thiazolyl) -2-thiourea,U-14624)對(duì)大鼠小腦PC和脊髓前角神經(jīng)元靜息膜電位及自發(fā)動(dòng)作電位的影響。 方法:本實(shí)驗(yàn)采用小腦和/或脊髓片可視法膜片鉗技術(shù),以大鼠小腦PC和脊髓前角細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察NA和DBH抑制劑U-14624對(duì)其靜息膜電位及自發(fā)動(dòng)作電位的影響。 結(jié)果: ①較之單細(xì)胞分離方法,小腦(脊髓)片可視法膜片鉗技術(shù)容易獲得適合膜片鉗記錄的細(xì)胞; ②正常脊髓前角神經(jīng)元的靜息膜電位幅度為-43.65±5.21 mV (n=48)。自發(fā)動(dòng)作電位頻率為1.62±0.26 Hz; ③正常小腦PC的靜息膜電位為-50.71±2.21 mV(n=39)。其自發(fā)動(dòng)作電位包括兩種形式,即簡(jiǎn)單鋒電位和復(fù)雜鋒電位,其頻率分別為2.86±0.31 Hz和35.37±5.63 Hz; ④NA作用后,脊髓前角神經(jīng)元的靜息膜電位幅度為-48.39±7.87 mV(n=24),自發(fā)動(dòng)作電位頻率為3.04±0.52 Hz; ⑤NA作用后,小腦PC的靜息膜電位幅度為-54.29±2.48 mV(n=22),其自發(fā)動(dòng)作電位發(fā)生不同的反應(yīng),表現(xiàn)為抑制、興奮和雙相反應(yīng)的細(xì)胞分別為68.18%、22.73%和9.09%; ⑥D(zhuǎn)BH抑制劑U-14624作用數(shù)min后,脊髓前角神經(jīng)元的靜息膜電位幅度為-38.39±4.19 mV,其自發(fā)動(dòng)作電位頻率為0.89±0.20 Hz; ⑦DBH抑制劑U-14624作用后,小腦PC的靜息膜電位變化不明顯,但其自發(fā)動(dòng)作電位頻率立即呈現(xiàn)高強(qiáng)度的聚集放電,頻率為30.74±13.20 Hz;至作用后5-20 min,則其自發(fā)動(dòng)作電位表現(xiàn)為興奮、抑制和雙相形式,分別占60%、33.33%和6.67%。 結(jié)論: ①小腦和/或脊髓片法得到的小腦和/或脊髓片,能夠較好的保存神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能,容易對(duì)其電活動(dòng)進(jìn)行記錄; ②NA對(duì)脊髓前角神經(jīng)元靜息膜電位和自發(fā)放電活動(dòng)的影響為興奮作用;NA對(duì)小腦PC自發(fā)動(dòng)作電位的影響較為復(fù)雜,以抑制作用為主。NA對(duì)脊髓前角神經(jīng)元和小腦PC的作用,可能通過(guò)直接與神經(jīng)元上相關(guān)的受體結(jié)合,或者通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作用,從而影響細(xì)胞的電活動(dòng); ③DBH抑制劑U-14624開(kāi)始灌流時(shí),對(duì)小腦PC自發(fā)動(dòng)作電位的影響主要表現(xiàn)的加強(qiáng),可能與該物質(zhì)直接作用于細(xì)胞有關(guān);其對(duì)脊髓前角神經(jīng)元自發(fā)動(dòng)作電位的影響主要以抑制為主,而對(duì)小腦PC的自發(fā)動(dòng)作電位以興奮為主。推測(cè)U-14624通過(guò)抑制DBH活性,影響了NA合成量減少,影響細(xì)胞的電活動(dòng)。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)NA及DBH抑制劑U-14624對(duì)小腦PC和脊髓前角神經(jīng)元電活動(dòng)的影響機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)的分析。為深入研究這兩種細(xì)胞的生理作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Part 1 the changes of NA neurons and the expression of AP-2 alpha in the Faure Marin induced rat model and regulation 1
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 張吉強(qiáng),姚青,劉建軍,蔡文琴;不同顯色方法對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)顯色結(jié)果的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年03期

2 賀桂瓊;孫善全;余會(huì)平;余維華;汪克建;梁益建;;嗎啡依賴(lài)和戒斷大鼠脊髓內(nèi)NA能神經(jīng)元變化的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年24期

3 賀桂瓊,孫善全;大鼠脊髓損傷后去甲腎上腺素能神經(jīng)元變化的初步研究[J];中華創(chuàng)傷雜志;2003年03期

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本文編號(hào)：1342702