本文關(guān)鍵詞：多亞型流感重組腺病毒疫苗生物反應(yīng)器制備、純化及免疫評(píng)價(jià)

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【摘要】：流行性感冒是由流感病毒引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的急性呼吸道傳染病,在過去的100年里引起了多次流感大流行,導(dǎo)致了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種是預(yù)防流感最有效的方法,但目前應(yīng)用的疫苗對(duì)快速變異的流感病毒缺乏保護(hù),因此研究新型流感疫苗成為當(dāng)務(wù)之急。流感重組腺病毒疫苗是目前的研究熱點(diǎn)之一,其穩(wěn)定性好、表達(dá)宿主細(xì)胞范圍廣、能夠誘導(dǎo)高水平的外源基因表達(dá)。生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)系統(tǒng)提高了細(xì)胞培養(yǎng)的表面積,生長環(huán)境單一,培養(yǎng)參數(shù)易于監(jiān)控,成為一種極具吸引力的新型替代技術(shù),用于各種細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大。大規(guī)模生產(chǎn)臨床所需的流感重組腺病毒疫苗需要使用安全高效的生產(chǎn)及純化方法。傳統(tǒng)的氯化銫密度梯度離心法適合少量的腺病毒純化,大規(guī)模生產(chǎn)中最有力和萬能的方法是色譜柱層析法。陰離子交換層析純化載量高、成本低廉,分子篩層析純化條件溫和、回收率高,因此腺病毒一般采用這兩種層析純化方式結(jié)合的方法進(jìn)行分離純化。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了以季節(jié)性流感H3亞型和大流行性流感H1亞型HA(HA1)基因?yàn)橹?輔助以已經(jīng)突破種間屏障感染人類的禽流感H5、H7、H9亞型HA抗原Th和B細(xì)胞表位盒(EHA)的多表位重組腺病毒疫苗。采用7L生物反應(yīng)器和Cytodex 1型微載體規(guī)�；a(chǎn)H1、H3等多亞型流感重組腺病毒,發(fā)酵產(chǎn)物采用陰離子交換層析純化和分子篩層析純化,兩步純化分別選用層析介質(zhì)Source 30Q和Sepharose 4FF,純化后的H3亞型流感重組腺病毒鑒定正確后,進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)。生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞,將2.8×108個(gè)細(xì)胞(1.6×104cells/mL)接種到生物反應(yīng)器中,通過多次試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)為:溫度為37℃,CO2濃度為5%,pH為7.0,溶氧為50%,攪拌速度為30rpm。培養(yǎng)24h后80%以上細(xì)胞貼壁,細(xì)胞總數(shù)開始顯著增長,48h-60h增長速率最高,72h后增長速度減慢,細(xì)胞數(shù)目達(dá)到1.4×109個(gè)(8×104cells/cm2),增加了5倍。培養(yǎng)96h后細(xì)胞細(xì)胞數(shù)開始下降,逐漸出現(xiàn)細(xì)胞壞死和脫落。培養(yǎng)H1、H3等多亞型流感重組腺病毒,以0.5 MOI接種病毒,48h后收取病毒,滴度為1.0×1010TCID50/mL。利用生物反應(yīng)器制備的重組腺病毒滴度為1.0×1010TCID50/mL,兩步純化后病毒滴度升高至1.1×1010TCID50/mL。經(jīng)陰離子交換層析純化回收率為31.5%,分子篩層析純化回收率為81.4%,兩步純化后回收率為25.6%。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行了PCR和Western blot鑒定證明基因未丟失、蛋白表達(dá)正確,通過檢測260nm和280nm處吸光度為A260/A280=1.26,初步證明符合純度要求。將發(fā)酵和純化得到的重組腺病毒進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn),對(duì)各免疫組進(jìn)行了體液免疫和細(xì)胞免疫水平檢測,結(jié)果顯示在特異性抗原H1,H3刺激下,經(jīng)過兩步純化的H1、H3等多亞型重組腺病毒IgG表達(dá)水平最高。重組腺病毒免疫小鼠后,IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果表明,兩個(gè)純化組表達(dá)細(xì)胞因子水平相當(dāng),顯著高于未純化組。綜合分析,經(jīng)兩步純化的H1、H3等多亞型重組腺病毒具有較強(qiáng)的刺激小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的能力,經(jīng)過一步純化的免疫組水平次之,均高于未純化組。生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)制備的H1、H3等多亞型流感重組腺病毒疫苗與種毒刺激小鼠產(chǎn)生的H1、H3亞型特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平基本相同。以上結(jié)果表明:利用生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)成功制備了H1、H3等多亞型流感重組腺病毒,并通過經(jīng)過兩步法層析純化進(jìn)行了分離純化,為重組腺病毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了初步的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
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本文編號(hào)：1305506