本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子Fli-1對巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-27的調(diào)控作用及其分子機(jī)制研究

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【摘要】：固有免疫應(yīng)答是機(jī)體防御感染性疾病的第一道防線。在固有免疫應(yīng)答過程中,宿主的不同免疫細(xì)胞是如何通過有限的受體迅速識別大量不同的病原微生物,并作出不同的應(yīng)答反饋是免疫學(xué)科中的一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面、內(nèi)體和溶酶體中,通過識別并結(jié)合相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)傳遞活化信號,從而激發(fā)一系列免疫應(yīng)答過程,繼而調(diào)控不同類型的趨化因子、干擾素和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,將病原體和異物清除。白細(xì)胞介素27(IL-27)屬于IL-6/IL-12細(xì)胞因子超家族,是IL-12細(xì)胞因子超家族中目前已知唯一既可促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展也可發(fā)揮抗炎作用的細(xì)胞因子。IL-27基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制目前尚未闡述清楚。本文主要研究了Friend白血病病毒插入位點(diǎn)1(Friend leukemia virusintegration 1,Fli-1)在巨噬細(xì)胞中對TLR4介導(dǎo)的IL-27產(chǎn)生的調(diào)控作用。我們發(fā)現(xiàn),經(jīng)細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,Fli-1的蛋白表達(dá)水平逐漸增加。在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Fli-1表達(dá)質(zhì)粒建立穩(wěn)定高表達(dá)Fli-1的細(xì)胞株,然后用LPS刺激穩(wěn)篩RAW264.7細(xì)胞株,再通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的方法檢測細(xì)胞中IL-27細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平和上清中IL-27的釋放,結(jié)果顯示高表達(dá)組細(xì)胞LPS誘導(dǎo)的IL-27 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和產(chǎn)生都明顯高于對照組細(xì)胞。同時(shí),我們利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)在小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞中敲低Fli-1的表達(dá),然后再用LPS刺激細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾組中LPS誘導(dǎo)的IL-27的轉(zhuǎn)錄水平和產(chǎn)生都明顯低于對照組細(xì)胞。染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin immunoprecitation,Ch IP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,LPS誘導(dǎo)下的Fli-1進(jìn)入細(xì)胞核后可直接與IL-27p28的啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合。為進(jìn)一步確定Fli-1與IL-27p28啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的具體位置,我們構(gòu)建了IL-27p28啟動(dòng)子區(qū)熒光報(bào)告基因質(zhì)粒并采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Fli-1與IL-27p28的啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-250到-150bp區(qū)段結(jié)合從而促進(jìn)IL-27的轉(zhuǎn)錄。Fli-1屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族,該家族成員可以特異性識別并結(jié)合GGA(A/T)共有序列來調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。而IL-27p28啟動(dòng)子區(qū)的-250到-150bp區(qū)段只有一個(gè)GGAA序列,位于-209/-206。將該GGAA序列點(diǎn)突變后,Fli-1介導(dǎo)的IL-27p28熒光報(bào)告基因的表達(dá)明顯下降,說明該GGAA序列是Fli-1調(diào)控IL-27p28啟動(dòng)子的主要結(jié)合位點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,Fli-1能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的IL-27的轉(zhuǎn)錄,從而正向調(diào)控TLR4介導(dǎo)的IL-27的產(chǎn)生。本研究首次發(fā)現(xiàn)Fli-1可以正向調(diào)控IL-27p28基因的轉(zhuǎn)錄。此外,Fli-1還可與MyD88和IRF1協(xié)同促進(jìn)IL-27p28熒光報(bào)告基因的表達(dá)水平。這些結(jié)果都將有助于進(jìn)一步了解天然免疫中炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)理及自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制,并為治療相關(guān)疾病提供潛在的藥物靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1271625