本文關鍵詞：RNA干擾端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因慢病毒表達載體的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：背景:端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)對端粒酶活化起重要作用,但利用構(gòu)建針對其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形膠質(zhì)細胞中的表達卻少有報道。目的:構(gòu)建用于RNA干擾的靶向大鼠脊髓源星形膠質(zhì)細胞端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的慢病毒載體,并觀察其對端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶表達的抑制作用。方法:通過設計合成出shRNA-TERT序列,經(jīng)聚合酶鏈反應擴增后定向連接到pLentilox3.7U6載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染DH5α細胞篩選陽性菌落后行測序鑒定。將pLentilox3.7U6-TERT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝產(chǎn)生重組慢病毒Le-TERT并測定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞,實時定量-聚合酶鏈反應檢測各細胞株TERT基因表達水平,并利用Western blot和免疫熒光分別檢測TERT蛋白的表達。結(jié)果與結(jié)論:基因測序鑒定證明,pLentilox3.7U6-TERT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并成功包裝慢病毒。實時定量PCR、Western blot和免疫熒光檢測結(jié)果表明,Le-TERT轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞4 d后,對TERT mRNA的干擾效率可達(63.98±2.6)%,Le-TERT在轉(zhuǎn)然后的星形膠質(zhì)細胞中呈低表達。結(jié)果證實,實驗構(gòu)建的重組表達載體pLentilox3.7U6-TERT能夠產(chǎn)生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞后,該載體可以有效抑制TERT的表達。
【作者單位】： 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院脊柱外科;四川省巴中市中心醫(yī)院骨科;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(81060106)~~
【分類號】：R373
【正文快照】： 0引言Introduction端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶的關鍵亞基,其表達與端粒酶活性相關,是調(diào)控端粒酶激活的主要因素。研究發(fā)現(xiàn),端粒酶表達與脊髓損傷后損傷區(qū)星形膠質(zhì)細胞介導的膠質(zhì)瘢痕形成程度相關。因此作者設計通過抑制TERT基因的表達來

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李振宇;慢病毒載體構(gòu)建及結(jié)構(gòu)優(yōu)化[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);2002年05期

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周軍智;鄒永康;李建國;劉楠喬;蔡亞非;王根林;;含PGK啟動子慢病毒表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定[J];安徽師范大學學報(自然科學版);2009年02期

2 周s，

本文編號：1251418