發(fā)布時(shí)間：2017-11-30 13:00

  本文關(guān)鍵詞：去甲腎上腺素對(duì)腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)控作用及機(jī)制研究

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【摘要】：中樞去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)能系統(tǒng)在多種重要的生理功能中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。腦干中的藍(lán)斑核(locus coeruleus,LC)是中樞NA的主要來(lái)源。盡管NA能神經(jīng)元的分布主要位于腦干當(dāng)中,但由這些神經(jīng)元所發(fā)出的纖維廣泛投射至包括脊髓在內(nèi)的整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在中樞的不同腦區(qū)當(dāng)中,主要存在三種受體,包括α1、α2以及β受體,介導(dǎo)了NA對(duì)不同腦區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)及相關(guān)功能的調(diào)控。然而,鑒于其受體種類(lèi)繁多,并且分布模式以及激活后對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的影響均呈現(xiàn)出多樣性,NA參與不同生理功能的細(xì)胞分子機(jī)制也十分復(fù)雜多樣,并因此引起了廣泛的關(guān)注。中樞NA能系統(tǒng)主要通過(guò)腦干發(fā)出的上行和下行通路,參與中樞不同功能的調(diào)節(jié)。盡管其上行通路參與認(rèn)知等腦高級(jí)功能的細(xì)胞分子層面的機(jī)制引起人們廣泛的研究興趣,其下行通路參與不同生理功能的機(jī)制近年來(lái)也同樣受到關(guān)注�；仡櫸墨I(xiàn)發(fā)現(xiàn),形態(tài)學(xué)研究表明,下行NA能系統(tǒng)支配了多個(gè)與中樞運(yùn)動(dòng)控制相關(guān)的腦區(qū),并且在脊髓以及內(nèi)側(cè)腦橋延髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(medial pontomedullary reticular formation,mPMRF)中存在較高密度的纖維分布。這樣的形態(tài)學(xué)分布特征提示了下行NA能系統(tǒng)在中樞運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。目前的研究已經(jīng)揭示了在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中,NA主要通過(guò)其興奮性調(diào)節(jié)作用參與中樞運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)。而mPMRF中存在脊髓投射的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元,其發(fā)出的纖維直接支配脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,兩者作為一個(gè)功能性整體在包括軀體姿勢(shì)控制、節(jié)律性運(yùn)動(dòng)以及隨意運(yùn)動(dòng)中的執(zhí)行中共同發(fā)揮了重要作用。然而目前尚不清楚NA是否以及如何調(diào)控mPMRF中網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的活動(dòng)。腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核(caudal pontine reticular nucleus,PnC)是mPMRF的重要組成部分,PnC中的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元介導(dǎo)了震驚運(yùn)動(dòng)(startle)這一姿勢(shì)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)。已有研究表明,在PnC中微量注射N(xiāo)A可以對(duì)大鼠震驚反射運(yùn)動(dòng)行為的幅度產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用,據(jù)此我們推測(cè)NA可能通過(guò)調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元,參與其介導(dǎo)的中樞運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)�；仡櫸墨I(xiàn),目前尚無(wú)NA對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)控機(jī)制的報(bào)道。因此,本文綜合采用形態(tài)學(xué)、全細(xì)胞膜片鉗以及神經(jīng)藥理學(xué)技術(shù),在細(xì)胞水平系統(tǒng)探索了NA對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的調(diào)控及機(jī)制。主要結(jié)果如下:1.α1以及α2受體共表達(dá)于單個(gè)pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中,其激活共同介導(dǎo)了na對(duì)pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細(xì)胞電流活動(dòng)的影響。為了明確na作用于pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的電生理效應(yīng),我們將其鉗制在-70mv,觀察短暫(3min)灌流3μm的na引起的全細(xì)胞電流變化。研究結(jié)果表明,na(3μm)在一部分pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中誘發(fā)內(nèi)向電流反應(yīng)(82/135例,60.7%),而在另一部分pnc神經(jīng)元中誘發(fā)外向電流反應(yīng)(53/135例,39.3%)。無(wú)論是na誘發(fā)的內(nèi)向(p=0.364,n=6)還是外向(p=0.511,n=6)電流反應(yīng),均不受ttx(1μm)的影響,提示突觸后的na能受體介導(dǎo)了na的效應(yīng)。結(jié)合藥理學(xué)手段研究后發(fā)現(xiàn),na所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應(yīng)可以被低濃度α1受體阻斷劑prazosin(pra,0.01μm)部分阻斷(p0.05,n=7),但高濃度的pra(10μm)使na在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向外向電流反應(yīng)。只有同時(shí)加入pra(10μm)以及α2受體阻斷劑yohimbine(yh,10μm)方可完全阻斷na(3μm)對(duì)該神經(jīng)元全細(xì)胞電流的影響(p0.01,n=7)。應(yīng)用同樣方法研究后發(fā)現(xiàn),na所誘發(fā)的外向電流反應(yīng)可以被低濃度α2受體阻斷劑yh(0.01μm)部分阻斷(p0.01,n=6),但高濃度的yh(10μm)使na在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向電流反應(yīng)。只有同時(shí)加入pra(10μm)以及yh(10μm)方可完全阻斷na(3μm)對(duì)該神經(jīng)元全細(xì)胞電流的影響(p0.01,n=6)。上述結(jié)果表明,pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后共表達(dá)有α1和α2受體,其激活在電壓鉗鉗制于-70mv的pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中分別介導(dǎo)了內(nèi)向和外向電流成分,兩者經(jīng)過(guò)不同整合后,表現(xiàn)為na在一部分神經(jīng)元誘發(fā)內(nèi)向電流,而在另一部分誘發(fā)外向電流。與此相一致的是,免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明,α1a和α2a受體亞型共表達(dá)于pnc中胞體直徑大于35μm的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中。2.突觸后α1和α2受體的激活,分別增加和抑制同一pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中灌流的acsf中加入了cnqx(10μm)、ap5(20μm)和picrotoxin(100μm),以阻斷pnc中的主要興奮及抑制性突觸傳遞。在此基礎(chǔ)上,我們于電流鉗模式(i=0)模式,直接記錄pnc網(wǎng)站脊髓神經(jīng)元的放電活動(dòng)。在該條件下,所有記錄的6例神經(jīng)元均表現(xiàn)出自發(fā)放電活動(dòng)(平均放電頻率:4.5±1.5hz;頻率變化范圍:1.7~11.6hz)。acsf灌流α1受體的激動(dòng)劑phenylephrine(pe,100μm)顯著增加了pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(p0.05;n=6);而在同一個(gè)的神經(jīng)元中,acsf灌流α2受體的激動(dòng)劑則顯著降低了pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(p0.05;n=6)。該結(jié)果不僅進(jìn)一步確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)室前期電壓鉗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,更進(jìn)一步揭示了pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1以及α2受體的激活可以在神經(jīng)元活動(dòng)層次對(duì)神經(jīng)元興奮性分別起到相反的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。3.pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1和α2受體激活分別偶聯(lián)的離子通道機(jī)制。在全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗條件下,應(yīng)用緩慢的斜坡電壓(slowramp)刺激(-125mv~+5mv,dv/dt=+10mv/s),我們可以得到α1以及α2受體激動(dòng)劑在pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元上所誘導(dǎo)的凈電流的電流-電壓關(guān)系曲線(i-vrelationshipcurve)。(1)突觸后α1受體的激活,通過(guò)開(kāi)放下游非選擇性陽(yáng)離子通道調(diào)控pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn),應(yīng)用pe(100μm)激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0mv;n=15)接近于文獻(xiàn)報(bào)道的非選擇性陽(yáng)離子通道電導(dǎo)(nonselectivecationicconductance,nscc)的平衡電位。并且在測(cè)試電壓范圍內(nèi)其i-v曲線均呈現(xiàn)出正向斜率,提示該通道開(kāi)放介導(dǎo)了α1受體激活對(duì)pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的興奮性調(diào)控效應(yīng)。進(jìn)一步應(yīng)用離子置換實(shí)驗(yàn)降低胞外na+濃度(由152.5mm降至70mm)不僅顯著降低了α1受體激活后引起的凈電流大小(p0.01;152.5mmna+:n=40;70mmna+:n=11),α1受體激活所得到的凈電流的平衡電位也符合預(yù)期的向更負(fù)的方向移動(dòng)(-42.9±4.2mv;p0.05;152.5mmna+:n=15;70mmna+:n=9)。上述結(jié)果表明,α1受體激活后可以激活nscc,調(diào)控pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)。文獻(xiàn)報(bào)道nscc主要包含na+以及k+成分,進(jìn)一步應(yīng)用翻轉(zhuǎn)電位以及戈德曼-霍奇金-卡茨方程(goldman-hodgkin-katzequation)計(jì)算得出在不同胞外na+濃度下的na+/k+通透比例后發(fā)現(xiàn),在兩種情況下其比例并無(wú)顯著差異(p=0.702;n=9)。該結(jié)果表明,α1受體激活后可能僅與nscc相偶聯(lián)。(2)突觸后α2受體的激活,通過(guò)關(guān)閉非選擇性陽(yáng)離子通道和開(kāi)放k+通道調(diào)控pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)。激活α2受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-23.5±4.3mv;n=10)同樣接近于nscc的平衡電位但略高于激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0mv;n=15)。此外,在其中3列神經(jīng)元中,除接近于nscc平衡電位的交點(diǎn)外,激活α2受體所得到的凈電流同時(shí)還存在接近k+平衡電位的交點(diǎn)(mean:-99.3±4.3mv)。該結(jié)果提示,與α1受體不同,α2受體下游可能同時(shí)偶聯(lián)了nscc以及k+電導(dǎo)。進(jìn)一步的離子置換實(shí)驗(yàn)表明,胞外na+濃度由152.5mm降至70mm顯著減弱了α2受體激活后所引起的凈電流幅度(p0.01;152.5mmna+:n=25;70mmna+:n=10)。與此同時(shí),胞外na+濃度由152.5mm將至70mm后,α2受體激活后所引起的凈電流在絕大多數(shù)測(cè)試的神經(jīng)元(n=6/7)中均呈現(xiàn)出兩個(gè)平衡電位:-109.9±4.7mv(依然接近于k+平衡電位,并且在低na+條件下出現(xiàn)概率增大)和-28.2±1.0mv(明顯高于低na+條件下nscc平衡電位的期待值,該期待值來(lái)自低na+條件下α1受體激活后的平衡電位,-42.9±4.2mv)。值得注意的是,在剩下的1個(gè)神經(jīng)元中,α2受體激活后所引起的凈電流僅呈現(xiàn)出一個(gè)平衡電位,-44.0mv,接近于低na+條件下nscc平衡電位的期待值。該結(jié)果表明,α2受體激活偶聯(lián)了k+通道,并且k+通道的活動(dòng)可能顯著影響在低na+(70mm)條件nscc平衡電位的觀測(cè)值,并使其向更正的方向移動(dòng)。的確,在acsf中加入k+通道廣譜阻斷劑ba2+后,α2受體激活后引起的凈電流幅度進(jìn)一步顯著減少(p0.05;70mmna+:n=10;1mmba2+:n=6),并且此時(shí)α2受體激活后引起的凈電流平衡電位僅存在一個(gè),-44.7±1.3mv(n=6),與上述低na+條件下nscc平衡電位的期待值也不在存在顯著差異(p=0.370)。該結(jié)果表明,α2受體激活后可以同時(shí)偶聯(lián)k+以及nscc兩種電導(dǎo)。并且在阻斷鉀離子后計(jì)算α2受體偶聯(lián)nscc的na+/k+通透比與α1受體所偶聯(lián)nscc的na+/k+通透比并不存在顯著差異(p=0.671;α1:n=24;α2:n=6),進(jìn)一步說(shuō)明兩者偶聯(lián)的為同一類(lèi)nscc通道。對(duì)α2受體激活引起的凈電流i-v關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),其在接近k+平衡電位呈現(xiàn)出正向斜率而在接近nscc附近呈現(xiàn)出負(fù)向斜率,說(shuō)明起激活后可以激活k+電導(dǎo)并關(guān)閉nscc。4.α2受體同時(shí)還表達(dá)于pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸前,并介導(dǎo)了na對(duì)mepsc的抑制性調(diào)控作用。在全細(xì)胞膜片鉗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用藥理學(xué)手段,在pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元上可以分離并記錄到微小興奮性突觸后電流(miniatureexcitatorypostsynapticcurrents,mepscs)和微小抑制性突觸后電流(miniatureinhibitorypostsynapticcurrents,mipscs)。na既不影響mipscs的頻率(p=0.428;n=6),也不影響mipscs的幅度(p=0.508;n=6)。與此不同,na顯著抑制了mepscs頻率(p0.01;n=7),但并不影響mepscs幅度(p=0.335;n=7)。該結(jié)果表明,na通過(guò)突觸前的機(jī)制抑制pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元mepsc。在acsf中灌流α2受體阻斷劑后,na對(duì)mepscs頻率(p=0.145;n=6)及幅度(p=0.994;n=6)均不在產(chǎn)生影響,說(shuō)明上述效應(yīng)是由突觸前α2受體所介導(dǎo)。與此一致,acsf中灌流α2受體激動(dòng)劑模擬了na對(duì)mepscs頻率(p0.05;n=5)的抑制效應(yīng),對(duì)其幅度(p=0.347;n=5)并無(wú)顯著影響。該部分結(jié)果表明,α2受體同時(shí)還表達(dá)于pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸前,并介導(dǎo)了na對(duì)mepsc的抑制性調(diào)控作用。5.na對(duì)mepsc的抑制效應(yīng)在功能活動(dòng)水平,參與了對(duì)pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元傳入興奮性信息的抑制性調(diào)控作用。在發(fā)現(xiàn)α2受體激活后抑制mepsc的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步想知道其激活對(duì)pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元接受的功能性興奮傳入的影響。利用同心圓電極在靠近記錄的pnc網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的位置進(jìn)行間隔50ms的連續(xù)電刺激,我們可以在神經(jīng)元上記錄到近旁刺激所誘發(fā)的興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)。ACSF中灌流NA強(qiáng)烈的抑制了eEPSC1的幅度(抑制百分比:47.1±4.9%;n=10)。同時(shí)其PPR(EPSC2/EPSC1)顯著增加(P0.05;n=10),說(shuō)明NA可以通過(guò)突觸前的機(jī)制抑制PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的興奮性信息傳入。在上述神經(jīng)元上,ACSF灌流α2受體阻斷劑,幾乎完全阻斷了NA對(duì)EPSC1的抑制效應(yīng)(P0.01;n=10),并且NA對(duì)PPR也不在產(chǎn)生影響(P=0.572;n=10),說(shuō)明上述機(jī)制由突觸前α2受體所介導(dǎo)。進(jìn)一步我們還發(fā)現(xiàn),NA在1-10μM范圍內(nèi)劑量依賴(lài)并穩(wěn)定的抑制了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元eEPSC1的幅度,并且伴隨的PPR的增加也呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)趨勢(shì)。更為重要的是,在所有測(cè)試的神經(jīng)元中,NA對(duì)eEPSC的抑制效應(yīng)與其引起的突觸后反應(yīng)大小無(wú)關(guān)(r=-0.0219,P=0.621;n=36),從而進(jìn)一步說(shuō)明NA上述效應(yīng)由且僅由突觸后α2受體所介導(dǎo)。綜上所述,本文研究結(jié)果系統(tǒng)闡明了NA對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后以及突觸前的調(diào)控效應(yīng)和機(jī)制。該研究結(jié)果為NA直接調(diào)控中樞運(yùn)動(dòng)相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元活動(dòng),并參與中樞運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)提供了新的神經(jīng)機(jī)制,并為我們下一步的行為學(xué)水平研究提供了新的方向。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R338

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2 關(guān)欣,寧斌,石玉秀;大鼠脊髓神經(jīng)元原代細(xì)胞的分散培養(yǎng)[J];第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年02期

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5 鮑t，

本文編號(hào)：1239365