本文關(guān)鍵詞：mTOR信號通路在iPS定向分化RPE細胞中的調(diào)控機制研究

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【摘要】：目的探討mTOR信號通路在iPS定向分化RPE細胞中的調(diào)控機制。方法培養(yǎng)iPS細胞,懸浮培養(yǎng)后形成擬胚體EB,誘導(dǎo)分化為RPE細胞。通過免疫細胞化學(xué)的方法,觀察iPS-RPE細胞分化一個月后特異性蛋白(RPE65、LRAT、zo-1)的表達。同時通過Q-PCR,Western Blotting的方法檢測iPS-RPE在不同分化時間點(分化1個月、2個月、3個月)上,iPS-RPE細胞中特異性基因、蛋白的表達變化以及mTOR信號通路的活性。最后應(yīng)用雷帕霉素抑制iPS-RPE細胞中mTOR的通路,進一步觀察iPS-RPE細胞中的蛋白表達變化。Q-PCR采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行組間比較。結(jié)果熒光顯微鏡觀察到iPS-RPE細胞在分化1個月時,表達RPE65、LRAT、zo-1蛋白。與對照組iPS比較,Q-PCR結(jié)果顯示,實驗組RPE65在分化1個月,2個月,3個月時的表達量分別為0.84±0.13,4.8±1.1,20.3±4.9(P=0.000);Best1分化1個月,2個月,3個月時的表達量分別為1.5±0.16,2.3±0.68,11.78±1.57(P=0.000);MerTK在分化1個月,2個月,3個月時的表達量分別為4.12±1.94,1.87±0.76,15.53±1.33(P=0.000),CK18分化1個月,2個月,3個月時的表達量分別為2.4±0.63,2.3±0.37,9.67±1.44(P=0.000),Western Blotting結(jié)果也表明,隨著分化時間延長,iPS-RPE細胞中特異性蛋白(BEST1、catenin、MerTK)表達量有顯著提高,而mTOR信號通路的活性受到抑制。與對照組(加DMSO)比較,雷帕霉素處理獲得的iPS-RPE細胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白表達量上升不是很明顯,catenin蛋白顯著提高。結(jié)論建立了體外高等分化、功能高效的iPS-RPE細胞,隨iPS-RPE細胞分化時間延長,mTOR信號通路的活性是逐步抑制的。
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科實驗室;
【基金】：眼科學(xué)國家重點實驗室開放課題(2013KF02) 江蘇省科教興衛(wèi)工程重點人才基金(RC201149)
【分類號】：R329.2
【正文快照】： RPE細胞是神經(jīng)視網(wǎng)膜外側(cè)的一層單層終末分化的細胞,當(dāng)RPE細胞中表達的基因(RPE65、RLBP1、LRAT等)存在先天突變,引起RPE功能障礙時,會引起各種遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病[1-2]。誘導(dǎo)多功能干細胞(inducedpluripotent stem cell,iPS)將成為細胞移植的一個重要來源,iPS可以無限期地

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