本文關(guān)鍵詞：mTOR信號(hào)通路在iPS定向分化RPE細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：目的探討mTOR信號(hào)通路在iPS定向分化RPE細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制。方法培養(yǎng)iPS細(xì)胞,懸浮培養(yǎng)后形成擬胚體EB,誘導(dǎo)分化為RPE細(xì)胞。通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法,觀察iPS-RPE細(xì)胞分化一個(gè)月后特異性蛋白(RPE65、LRAT、zo-1)的表達(dá)。同時(shí)通過Q-PCR,Western Blotting的方法檢測(cè)iPS-RPE在不同分化時(shí)間點(diǎn)(分化1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月)上,iPS-RPE細(xì)胞中特異性基因、蛋白的表達(dá)變化以及mTOR信號(hào)通路的活性。最后應(yīng)用雷帕霉素抑制iPS-RPE細(xì)胞中mTOR的通路,進(jìn)一步觀察iPS-RPE細(xì)胞中的蛋白表達(dá)變化。Q-PCR采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行組間比較。結(jié)果熒光顯微鏡觀察到iPS-RPE細(xì)胞在分化1個(gè)月時(shí),表達(dá)RPE65、LRAT、zo-1蛋白。與對(duì)照組iPS比較,Q-PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組RPE65在分化1個(gè)月,2個(gè)月,3個(gè)月時(shí)的表達(dá)量分別為0.84±0.13,4.8±1.1,20.3±4.9(P=0.000);Best1分化1個(gè)月,2個(gè)月,3個(gè)月時(shí)的表達(dá)量分別為1.5±0.16,2.3±0.68,11.78±1.57(P=0.000);MerTK在分化1個(gè)月,2個(gè)月,3個(gè)月時(shí)的表達(dá)量分別為4.12±1.94,1.87±0.76,15.53±1.33(P=0.000),CK18分化1個(gè)月,2個(gè)月,3個(gè)月時(shí)的表達(dá)量分別為2.4±0.63,2.3±0.37,9.67±1.44(P=0.000),Western Blotting結(jié)果也表明,隨著分化時(shí)間延長(zhǎng),iPS-RPE細(xì)胞中特異性蛋白(BEST1、catenin、MerTK)表達(dá)量有顯著提高,而mTOR信號(hào)通路的活性受到抑制。與對(duì)照組(加DMSO)比較,雷帕霉素處理獲得的iPS-RPE細(xì)胞中BEST1、MerTK、ck18蛋白表達(dá)量上升不是很明顯,catenin蛋白顯著提高。結(jié)論建立了體外高等分化、功能高效的iPS-RPE細(xì)胞,隨iPS-RPE細(xì)胞分化時(shí)間延長(zhǎng),mTOR信號(hào)通路的活性是逐步抑制的。
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2013KF02) 江蘇省科教興衛(wèi)工程重點(diǎn)人才基金(RC201149)
【分類號(hào)】：R329.2
【正文快照】： RPE細(xì)胞是神經(jīng)視網(wǎng)膜外側(cè)的一層單層終末分化的細(xì)胞,當(dāng)RPE細(xì)胞中表達(dá)的基因(RPE65、RLBP1、LRAT等)存在先天突變,引起RPE功能障礙時(shí),會(huì)引起各種遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病[1-2]。誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(inducedpluripotent stem cell,iPS)將成為細(xì)胞移植的一個(gè)重要來源,iPS可以無限期地

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