本文關(guān)鍵詞：抗人神經(jīng)菌毛素1 b1b2區(qū)單克隆抗體的制備及其單鏈抗體原核表達(dá)菌的制備

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【摘要】：神經(jīng)菌毛素-1 (Neuropilin-1; NRP1)是一種多功能的非酪氨酸激酶受體,可結(jié)合III類神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子(SEMA 3)介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,同時,通過與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合調(diào)節(jié)血管的生成,尤其是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。NRP1由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成,目前發(fā)現(xiàn)其胞外區(qū)的功能更為重要,胞外區(qū)分為a1a2、b1b2、c結(jié)構(gòu)域,VEGF165主要通過與NRP1胞外區(qū)blb2結(jié)構(gòu)域結(jié)合發(fā)揮作用。因此,本課題組通過基因工程技術(shù)克隆得到人NRP1 b1b2 (HuNRP1b1b2)結(jié)構(gòu)域cDNA并表達(dá)其重組蛋白,通過雜交瘤技術(shù)獲得特異性針對HuNRP-1b1b2單克隆抗體(McAbs)并初步分析其生物學(xué)功能發(fā)現(xiàn)其可以與天然NRP1結(jié)合并且能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管。選擇有生物學(xué)活性的雜交瘤細(xì)胞株通過基因工程技術(shù)提取mAb的重鏈及輕鏈編碼基因,構(gòu)建含抗人神經(jīng)菌毛素單鏈抗體(single chain Fragment variable, ScFv)編碼基因的重組載體并進(jìn)行原核表達(dá)。目的：構(gòu)建抗HuNRP1b1b2單克隆抗體并研究其生物學(xué)活性,制備單鏈抗體原核表達(dá)菌,為進(jìn)一步研究HuNRP1b1b2生物學(xué)的功能提供生物材料。方法：①克隆HuNRP1b1b2區(qū)的編碼基因并對其進(jìn)行蛋白表達(dá)；②制備抗HuNRP-1b1b2的mAb并分析其生物學(xué)特性；③提取陽性雜交瘤細(xì)胞株的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法獲取抗HuNRP1b1b2重鏈可變區(qū)(Heavy Variable, VH)及輕鏈可變區(qū)(Light Variable,VL)的基因序列；④用重疊PCR (overlap-PCR)方法獲取抗HuNRP1b1b2 ScFV序列；⑤通過雙酶切及定向克隆技術(shù)把ScFV克隆到噬菌粒pCANTAB5E載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCANTAB5E-ScFV;⑥將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1菌。結(jié)果：①獲得人神經(jīng)菌毛素1的blb2區(qū)蛋白,大小約34 kDa。②獲得穩(wěn)定分泌抗HuNRP1b1b2 McAbs細(xì)胞株,命名為6A2與1A10。③單克隆抗體能夠識別天然NRP1,可有效抑制HUVEC的遷移并對HUVEC的體外成管能力具有一定的抑制作用。④通過噬菌體表面展示技術(shù),初步獲得HuNRP1b1b2單鏈抗體。結(jié)論：獲得HuNRP1b1b2單克隆抗體,且單克隆抗體具有與天然NRP1的結(jié)合能力,并且能夠抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管。通過噬菌體表面展示技術(shù),初步獲得HuNRP1b1b2單鏈抗體,為進(jìn)一步研究HuNRP1的生物學(xué)功能墊下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1156471