本文關(guān)鍵詞：核蛋白PCNP對小鼠DC細(xì)胞遷移與增殖能力的影響

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【摘要】：背景PCNP(PEST-Containing Nuclear Protein)是于2002年新發(fā)現(xiàn)的一種含有PEST序列的核蛋白,它是泛素連接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING Figer Protein)的底物。NIRF包含類泛素化區(qū)域(a ubiquitin-like domain),YDG/SRA區(qū)域(a YDG/SRA domain),PHD區(qū)域(a PHD domain)和指環(huán)狀區(qū)域(a RING domain)等四個(gè)區(qū)域,研究發(fā)現(xiàn)NIRF在正常細(xì)胞增殖期間呈現(xiàn)高表達(dá),而在G0/G1期間呈現(xiàn)低表達(dá)。核蛋白PCNP包含的PEST序列中含有豐富的脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T),是短壽命蛋白。而含有PEST序列的功能蛋白質(zhì)通常是通過水解途徑調(diào)控,且大多數(shù)是通過泛素介導(dǎo)途徑降解。NIRF本身具有泛素連接酶的特征,且其自身具有自動(dòng)泛素酶的活性。泛素依賴性蛋白的降解可以調(diào)節(jié)依靠泛素化途徑的多種細(xì)胞周期的過程,目前研究證實(shí),這些過程包括細(xì)胞的周期進(jìn)程、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、DNA的損傷和變異。NIRF泛素連接酶與被降解蛋白質(zhì)的特異性底物PCNP結(jié)合,進(jìn)而影響泛素化反應(yīng)的功能與效率。例如核蛋白PCNP在293T細(xì)胞和COS-7細(xì)胞中是很容易被泛素化,在體內(nèi)或體外NIRF都能夠把PCNP泛素化。這說明NIRF與PCNP信號軸可能通過對細(xì)胞周期的調(diào)控而對細(xì)胞增殖發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)研究表明,在很多腫瘤細(xì)胞基因中NIRF在9p23-24.1段基因出現(xiàn)的頻繁明顯高于正常細(xì)胞,推測PCNP和NIRF可能也與腫瘤發(fā)生有一定的關(guān)系。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells DC)是目前確定的唯一能激活初始T細(xì)胞的專職抗原遞呈細(xì)胞,能高效地?cái)z取加工、處理、遞呈抗原,DC數(shù)量極少,僅占單核細(xì)胞的1%,未成熟遷移能力強(qiáng)。微量的LPS就能刺激DC合成與釋放細(xì)胞因子(TNF-α)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),小鼠脾臟中CD8α+DC細(xì)胞中PCNP的m RNA水平高表達(dá)。前期結(jié)果顯示沉默PCNP能抑制DC增殖。目前在DC細(xì)胞中對PCNP的研究尚未報(bào)道。本課題初步探討了核蛋白PCNP在DCs中的作用及其分子機(jī)制。目的1、探索PCNP過表達(dá)和沉默對DC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。2、探討LPS和蛋白酶體抑制劑“MG-132”對PCNP過表達(dá)和沉默后的DC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法1、DC2.4細(xì)胞對照(未處理)組:用流式細(xì)胞儀,檢測DC-PCNP-Flag、DC-sh-PCNP及其相應(yīng)對照組穩(wěn)定株的表面分子MHC II及共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)。用Transwell小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),研究PCNP過表達(dá)與沉默后對DC細(xì)胞遷移的影響。用平板克隆實(shí)驗(yàn),研究PCNP沉默和過表達(dá)后對DC細(xì)胞克隆形成能力的影響。2、實(shí)驗(yàn)組:在DC2.4細(xì)胞中分別加入LPS和蛋白酶體抑制劑(MG-132);檢測對DC細(xì)胞形態(tài)、遷移、克隆形成能力的影響。結(jié)果1、成功建立PCNP-Flag及PCNP-EGFP過表達(dá)穩(wěn)定株。2、成功篩選得到過表達(dá)穩(wěn)定株DC-Flag(對照組)、DC-PCNP-Flag、DC-EGFP(對照組)、DC-PCNP-EGFP;沉默穩(wěn)定株DC-RNAi-NC(Negative Control NC)和DC-sh-PCNP穩(wěn)定株。3、DC-PCNP-Flag穩(wěn)定株與對照組相比,細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;DC-sh-PCNP穩(wěn)定株與對照組相比,細(xì)胞形態(tài)也無明顯變化。4、經(jīng)流式檢測,DC-PCNP-Flag穩(wěn)定株與對照組相比,其表面分子MHC II和共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而DC-sh-PCNP穩(wěn)定株與對照組相比,其表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)量也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其各自的表面分子MHC II均無明顯變化。5、經(jīng)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn))發(fā)現(xiàn)PCNP過表達(dá)組(DC-PCNP-Flag)DC2.4穩(wěn)定株與對照組細(xì)胞相比,其遷移能力下降(P㩳0.05),而PCNP沉默組(DC-sh-PCNP)穩(wěn)定株與對照組相比,其遷移能力增強(qiáng)(P㩳0.01)。6、平板克隆實(shí)驗(yàn),證明PCNP沉默后在DC細(xì)胞中抑制克隆形成能力(P㩳0.05),而PCNP過表達(dá)后能促進(jìn)DC細(xì)胞的克隆形成能力(P㩳0.01)。7、加入LPS后,DC細(xì)胞PCNP的沉默組與過表達(dá)組均促進(jìn)DC的遷移能力,而兩組間相比無差異(P㧐0.05);加入MG-132后,DC細(xì)胞PCNP的沉默組與過表達(dá)組均抑制DC的遷移能力,而兩組間相比也無差異(P㧐0.05);而LPS和MG-132對DC細(xì)胞的遷移能力的作用相反(P㩳0.01)。8、加入LPS后,DC細(xì)胞PCNP的沉默組與過表達(dá)組均促進(jìn)DC的克隆形成能力,而兩組間相比無差異(P㧐0.05);加入MG-132后,在DC細(xì)胞PCNP沉默組與過表達(dá)組均抑制DC的克隆形成能力,而兩組間相比也無差異(P㧐0.05);而LPS和MG-132對DC細(xì)胞的克隆形成能力的作用相反(P㩳0.01)。結(jié)論1、DC未成熟時(shí)(沒有LPS刺激時(shí)),PCNP對DC2.4細(xì)胞的形態(tài)、表面分子、均無影響,但能夠抑制DC2.4細(xì)胞的遷移能力,提高DC2.4細(xì)胞的克隆形成能力。2、5ug/ML LPS刺激時(shí)(DC成熟時(shí))能夠提高DC遷移、克隆形成能力,但此時(shí)的作用與PCNP無關(guān)。3、10ug/ML蛋白酶體抑制劑(MG-132)能抑制DC細(xì)胞的遷移和克隆形成能力,反之,LPS則能促進(jìn)DC細(xì)胞的遷移和克隆形成能力,但此時(shí)的作用與PCNP無關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：PCNP DC細(xì)胞 MG-132 LPS 克隆形成能力
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 縮略詞表13-15
• 1 引言15-17
• 2 材料17-25
• 2.1 使用的主要試劑17-19
• 2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑17
• 2.1.2 蛋白和RNA相關(guān)試劑17-18
• 2.1.3 相關(guān)抗體18-19
• 2.2 主要儀器設(shè)備19-20
• 2.3 主要溶劑的配制和方法20-25
• 3 方法25-35
• 3.1 免疫熒光實(shí)驗(yàn)（鑒定DC2.4 細(xì)胞）25
• 3.2 引物設(shè)計(jì)25-26
• 3.3 Ecoli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備26-27
• 3.4 轉(zhuǎn)化27
• 3.5 挑取陽性克隆27-28
• 3.6 PCMV-C-Flag及所用質(zhì)粒的提取28
• 3.7 質(zhì)粒的驗(yàn)證28
• 3.8 DC2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染28-29
• 3.9 DC2.4 細(xì)胞m RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄29-30
• 3.10 RT-PCR30-31
• 3.11 DC2.4 細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取和濃度測定（BCA法）31
• 3.12 免疫印跡雜交法31-33
• 3.13 流式細(xì)胞術(shù)對DC2.4 細(xì)胞膜表面表達(dá)分子及表面共刺激的分子的檢測（直接標(biāo)記法）33
• 3.14 DC2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)33
• 3.15 DC2.4 細(xì)胞小室實(shí)驗(yàn)33-34
• 3.16 DC2.4 細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)34
• 3.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34-35
• 4 結(jié)果35-51
• 4.1 DC2.4 細(xì)胞鑒定35-37
• 4.2 PCNP片斷和CDS區(qū)全長37-38
• 4.3 成功建立PCNP過表達(dá)及沉默穩(wěn)定株（RT-PCR驗(yàn)證）38
• 4.4 成功構(gòu)建PCNP過表達(dá)及沉默穩(wěn)定株（Western Blot驗(yàn)證）38-40
• 4.5 PCNP過表達(dá)與沉默對DC2.4 細(xì)胞形態(tài)的影響40-41
• 4.6 PCNP 過表達(dá)與沉默對 DC 表面分子 MHCII 及表面共刺激分子CD80、CD86 的影響41-42
• 4.7 PCNP過表達(dá)與沉默對DC細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）42-43
• 4.8 PCNP過表達(dá)與沉默對DC細(xì)胞遷移的影響（T實(shí)驗(yàn)）43-44
• 4.9 PCNP過表達(dá)與沉默對DC細(xì)胞克隆形成能力的影響（平板克隆實(shí)驗(yàn)）44-45
• 4.10 分別用LPS和MG-132 處理DC2.4 細(xì)胞的PCNP基因沉默和過表達(dá)穩(wěn)定株，，檢測處理后DC2.4 細(xì)胞形態(tài)的變化45-46
• 4.11 PCNP沉默和過表達(dá)后的DC2.4 細(xì)胞再分別用LPS和MG-132 處理，檢測對DC細(xì)胞遷移的影響46-47
• 4.12 DC2.4 細(xì)胞經(jīng)PCNP沉默和過表達(dá)后分別用LPS和MG-132 處理，觀察對DC細(xì)胞克隆形成能力的影響47-49
• 4.13 PCNP 沉默和過表達(dá)后再分別用 LPS 和 MG-132 處理對 DC2.4細(xì)胞 TNF-α 表達(dá)的影響49-51
• 小結(jié)51-53
• 討論53-59
• 結(jié)論59-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 綜述65-87
• 參考文獻(xiàn)82-87
• 致謝87-89
• 在讀期間參加的學(xué)術(shù)會(huì)議及研究成果89-90

【相似文獻(xiàn)】

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1 高倬,孟凡虹;野蕎根素對四種人癌細(xì)胞克隆形成能力的影響[J];中國中藥雜志;1993年08期

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1 鄭小麗;核蛋白PCNP對小鼠DC細(xì)胞遷移與增殖能力的影響[D];河南大學(xué);2016年

本文編號：1132096