本文關(guān)鍵詞：含EGFP報(bào)告基因單順反子HCV亞基因組復(fù)制子載體的構(gòu)建和表達(dá)

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【摘要】：目的構(gòu)建含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的HCV復(fù)制子表達(dá)載體,并實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞中的復(fù)制表達(dá)。方法用分子生物學(xué)基因克隆技術(shù)對HCV 2a型復(fù)制子的基因進(jìn)行改造,用EGFP基因替代HCV基因組中的包膜基因(E1和E2)體外構(gòu)建重組單順反子HCV亞基因組復(fù)制子真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-JFH1-EGFP,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析和測序鑒定;脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞,用熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá),采用半定量RT-PCR方法檢測重組復(fù)制子的HCV RNA負(fù)鏈,采用Western blot檢測HCV NS3蛋白的復(fù)制表達(dá),并觀察IFN-α對重組質(zhì)粒表達(dá)的HCV RNA復(fù)制的抑制作用。結(jié)果構(gòu)建的4個(gè)重組質(zhì)粒酶切分析與預(yù)期相符,HCV亞基因復(fù)制子表達(dá)載體中未發(fā)生EGFP和HCV編碼區(qū)讀碼框架改變,轉(zhuǎn)染重組載體Huh-7細(xì)胞檢測到HCV負(fù)鏈及EGFP和HCV NS3蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h,1 000IU/ml和2 000IU/ml IFN-α處理的細(xì)胞HCV RNA表達(dá)水平分別為未處理組的20.0%和7.6%。結(jié)論含EGFP報(bào)告基因的單順反子HCV亞基因組復(fù)制子表達(dá)載體pcDNA-JFH1-EGFP構(gòu)建成功,在Huh-7細(xì)胞中能有效復(fù)制表達(dá),為進(jìn)一步研究HCV提供了實(shí)驗(yàn)平臺。
【作者單位】： 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系;
【關(guān)鍵詞】： 丙型肝炎病毒 復(fù)制子 綠色熒光蛋白 基因表達(dá)
【基金】：湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013SK3069,2014SK3248)
【分類號】：R373.21
【正文快照】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是丙型肝炎的病原體,感染慢性化程度高,并可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。目前治療手段局限,也無預(yù)防性疫苗[1]。1999年Lohmann等[2]成功建立了選擇性雙順反子亞基因組HCV RNA復(fù)制子系統(tǒng),該復(fù)制子能在人肝癌細(xì)胞系Huh-7中高水平自主復(fù)制,這被

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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【相似文獻(xiàn)】

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中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1132026