本文關(guān)鍵詞：EB病毒對WIF1基因甲基化和表達(dá)影響的研究

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【摘要】：EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)為嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的DNA腫瘤病毒,EBV感染與部分胃癌發(fā)生的關(guān)系已經(jīng)確認(rèn),EBV相關(guān)胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC)約占胃癌總數(shù)的10%。EBVaGC發(fā)生的表觀遺傳學(xué)機(jī)制的研究主要涉及EBV感染對抑癌基因啟動子區(qū)甲基化的影響,以及EBV非編碼RNA對宿主基因表達(dá)調(diào)控作用兩個方面。目的明確EBV感染對Wnt抑制因子1(Wnt inhibitory factor-1,WIF1)編碼基因啟動子區(qū)甲基化以及EBV編碼miRNA BART19-3p對WIF1表達(dá)的影響,為進(jìn)一步探討EBV抑制WIF1表達(dá),進(jìn)而異常激活Wnt原癌基因通路參與EBVaGC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。方法選取2種EBV陽性胃癌細(xì)胞系GT38、GT39和3種EBV陰性胃癌細(xì)胞系HGC-27、MKN-45、SGC7901作為研究對象,采用實時熒光定量PCR(Real time quantitative PCR,real time qPCR)檢測上述細(xì)胞系WIF1表達(dá)水平,亞硫酸氫鹽基因組測序法(Bisufite genomic sequencing,BGS)檢測WIF1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。并分別采用5-Aza-CdR、BART19-3p模擬物以及抑制物作用EBV陽性胃癌細(xì)胞系GT38和EBV陰性胃癌細(xì)胞系HGC-27,檢測藥物作用前后2種細(xì)胞系WIF1和β-catentin表達(dá)水平的變化以及細(xì)胞增殖情況。結(jié)果①BGS檢測結(jié)果結(jié)果顯示,5種胃癌細(xì)胞系WIF1啟動子區(qū)均呈高甲基化狀態(tài),甲基化率均在85%以上。②real time qPCR結(jié)果顯示,胃癌細(xì)胞系中WIF1表達(dá)普遍下調(diào),以EBV陽性細(xì)胞系GT38和GT39下降更為明顯;5-Aza-CdR作用后GT38和HGC-27兩種細(xì)胞系WIF1表達(dá)均上調(diào),其中HGC-27上調(diào)更為顯著;同時,Western Blot顯示兩種細(xì)胞系β-catenin水平均下調(diào)。③EBV陰性細(xì)胞系HGC-27轉(zhuǎn)染外源性BART19-3p模擬物后,WIF1表達(dá)進(jìn)一步下調(diào),β-catenin水平升高,細(xì)胞增殖率增加。④EBV陽性細(xì)胞GT38轉(zhuǎn)染外源性BART19-3p抑制物后,WIF1表達(dá)水平升高,β-catenin表達(dá)水平下調(diào),細(xì)胞生長抑制率增加。結(jié)論①EBV陰性和陽性細(xì)胞系中WIF1表達(dá)水平均較低,EBV陽性細(xì)胞系中表達(dá)缺失或下調(diào)情況更為明顯,去甲基化試劑5-Aza-CdR處理可不同程度上調(diào)GT38及HGC-27細(xì)胞系WIF1表達(dá),EBV陰性細(xì)胞系HGC-27上調(diào)更為明顯。②外源性BART19-3p模擬物轉(zhuǎn)染EBV陰性細(xì)胞系HGC-27可進(jìn)一步抑制WIF1表達(dá),抑制β-Catenin降解,促進(jìn)其積聚。提示BART19-3p可拮抗WIF1對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用,進(jìn)而在EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。③外源性BART19-3p抑制物轉(zhuǎn)染EBV陽性細(xì)胞系GT38可抑制EBV編碼的BART19-3p的作用,WIF1表達(dá)上調(diào),從而抑制β-catenin的積聚,進(jìn)一步證明BART19-3p對WIF1的抑制作用。④盡管普遍認(rèn)為EBV對宿主表觀遺傳學(xué)的影響主要為抑癌基因啟動子區(qū)甲基化,但就WIF1而言,其編碼miRNAs可能發(fā)揮主要作用。
【關(guān)鍵詞】：Wnt通路抑制因子1 EB病毒 微小RNA 甲基化 胃癌
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.11
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 第一章 材料與方法11-21
• 1.1 儀器、試劑和耗材11-12
• 1.1.1 主要儀器11
• 1.1.2 主要試劑和耗材11-12
• 1.2 核酸提取12-14
• 1.2.1 細(xì)胞系DNA提取12-13
• 1.2.2 細(xì)胞系RNA提取13
• 1.2.3 總RNA純化13-14
• 1.3 細(xì)胞的處理14-15
• 1.3.1 實驗前準(zhǔn)備14
• 1.3.2 首次傳代前細(xì)胞的復(fù)蘇14
• 1.3.3 培養(yǎng)液的更換14
• 1.3.4 細(xì)胞傳代14-15
• 1.3.5 5-Aza-CdR作用15
• 1.3.6 miRNAs轉(zhuǎn)染15
• 1.4 DNA樣本亞硫酸鹽處理15-16
• 1.4.1 DNA前處理16
• 1.4.2 亞硫酸鹽修飾及純化16
• 1.4.3 修飾后處理16
• 1.5 WIF1甲基化狀態(tài)檢測16-17
• 1.5.1 甲基化特異性PCR (MSP)16-17
• 1.5.2 亞硫酸鹽基因測序17
• 1.6 WIF1 mRNA檢測17-18
• 1.6.1 RT-PCR17-18
• 1.6.2 實時熒光定量PCR18
• 1.6.3 Real-time qPCR結(jié)果數(shù)據(jù)分析18
• 1.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性18-19
• 1.8 瓊脂糖凝膠電泳19
• 1.8.1 凝膠制備19
• 1.8.2 電泳19
• 1.8.3 顯色19
• 1.9 Western Blot檢測目的基因的表達(dá)19-21
• 第二章 結(jié)果21-29
• 2.1 胃癌細(xì)胞系WIF1啟動子甲基化狀態(tài)BGS檢測結(jié)果21
• 2.2 WIF1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)21-22
• 2.3 5-Aza-CdR對WIF1基因甲基化狀態(tài)的影響22
• 2.4 5-Aza-CdR對WIF1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響22-23
• 2.5 BART19-3p模擬物和抑制物對WIF1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響23
• 2.6 5-Aza-CdR對細(xì)胞增殖的影響23-25
• 2.7 BART19-3p模擬物對細(xì)胞增殖的影響25-26
• 2.8 BART19-3p抑制物對細(xì)胞增殖的影響26-27
• 2.9 5-Aza-CdR對 β-catenin表達(dá)水平的影響27
• 2.10 BART19-3p模擬物和抑制物對 β-catenin表達(dá)的影響27-29
• 第三章 討論29-32
• 結(jié)論32-33
• 參考文獻(xiàn)33-36
• 綜述36-52
• 綜述參考文獻(xiàn)47-52
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果52-53
• 致謝53-54

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