本文關(guān)鍵詞：糖基工程酵母表面呈現(xiàn)抗體庫的構(gòu)建和抗真菌β-甘露糖型抗體的篩選

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【摘要】：近幾年來,抗體藥物是市場(chǎng)上生物藥物的主要品種之一,全球銷量最佳的生物藥物中抗體藥物占據(jù)很大比例。幾乎所有抗體藥物的表達(dá)系統(tǒng)都是基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),這是因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物與天然分子相近,例如翻譯后的糖基化修飾。但同時(shí),哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)成本高、周期長(zhǎng),使其已嚴(yán)重阻礙了抗體藥物的發(fā)展。相比而言,畢赤酵母作為一種真核生物,具有繁殖速度快,產(chǎn)量高,培養(yǎng)成本低等優(yōu)勢(shì),可以用于各種重組蛋白的表達(dá)和分泌。而經(jīng)過糖基工程改造之后的酵母細(xì)胞,其蛋白質(zhì)的糖基化修飾接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)雜型糖型,而不再是一般酵母的高甘露糖型,與天然分子更加相似。糖基工程酵母的蛋白表達(dá)的糖基化修飾與真核細(xì)胞十分相似,且相比于哺乳動(dòng)物細(xì)胞成本更低,產(chǎn)量更高,糖基工程酵母有望成為包括抗體在內(nèi)的糖蛋白藥物的制備的新途徑�？贵w庫技術(shù)是目前發(fā)現(xiàn)特異性抗體的重要手段之一,基于該技術(shù)篩選抗體高效而快捷,能夠同時(shí)進(jìn)行不同抗原靶位的篩選,成為尋找、制備、研發(fā)新的單抗藥物的重要方式。從構(gòu)建方式上可將抗體庫分為哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫、噬菌體抗體庫和酵母抗體庫等。其中噬菌體抗體庫因其構(gòu)建方法簡(jiǎn)單,庫容量大等優(yōu)點(diǎn)是目前所用最多的抗體庫,但噬菌體抗體庫表達(dá)多為單鏈抗體,現(xiàn)如今絕大多數(shù)通過抗體庫篩選得到的抗體,其結(jié)構(gòu)都不是抗體的天然構(gòu)象,多為單鏈抗體,因此需要在篩選之后重新進(jìn)行完整抗體的構(gòu)建和表達(dá),步驟較為復(fù)雜。本研究使用錨定蛋白Sed,構(gòu)建糖基工程酵母表面呈現(xiàn)抗體庫。使用Sed錨定蛋白在實(shí)現(xiàn)半抗體在酵母細(xì)胞表面展示的同時(shí),還具備分泌完整結(jié)構(gòu)單克隆抗體的能力,即與錨定蛋白串聯(lián)表達(dá)的Fc段,可以與分泌抗體的Fc結(jié)合通過二硫鍵聚合,將抗體結(jié)構(gòu)的一半即半抗體錨定在酵母細(xì)胞表面,錨定在細(xì)胞上的半抗體既可以保持最初的生物活性,也可以保持原有的結(jié)構(gòu),不因定位在細(xì)胞表面而使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,利用這種雙重模式,在保留抗體完整結(jié)構(gòu)的情況下,達(dá)到篩選和表達(dá)分泌的統(tǒng)一。本研究利用糖基工程酵母構(gòu)建表面呈現(xiàn)免疫抗體庫,具體步驟如下:抗禽流感血凝素(HA7)抗體質(zhì)粒庫的構(gòu)建:禽流感血凝素HA7作為抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,在三次免疫之后提取小鼠脾臟細(xì)胞,對(duì)小鼠脾臟進(jìn)行研磨,提取RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增小鼠脾臟細(xì)胞的輕重鏈可變區(qū)基因,和人源Ig G的恒定區(qū)基因同框融合構(gòu)建抗HA7的抗體質(zhì)粒庫,獲得約104的單克隆,隨機(jī)挑選10個(gè)單克隆測(cè)序,對(duì)比序列結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨機(jī)挑選的10個(gè)單克隆序列均具有抗體骨架結(jié)構(gòu),同時(shí)可變區(qū)序列各不相同,說明質(zhì)粒庫的基因多態(tài)性良好。糖基工程酵母表面呈現(xiàn)的免疫抗體庫的構(gòu)建:將錨定蛋白與抗體Fc段(Fc-Sed)融合表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化糖基工程酵母細(xì)胞,陽性轉(zhuǎn)化克隆培養(yǎng)誘導(dǎo)后,用抗Ig G-Fc抗體流式細(xì)胞檢測(cè)、篩選,獲得在糖基工程酵母表面錨定表達(dá)Fc-Sed融合蛋白的酵母細(xì)胞。將構(gòu)建好的質(zhì)粒庫電轉(zhuǎn)化表達(dá)了Fc-Sed融合蛋白的糖基工程酵母細(xì)胞,構(gòu)建表面抗體庫。免疫磁珠法篩選抗體庫:因?yàn)槊庖叽胖楹Y選方法簡(jiǎn)單、快捷,本研究采用免疫磁珠的篩選方式。先用空羧基磁珠通過縮合反應(yīng)將HA7蛋白結(jié)合在磁珠表面,之后將該磁珠加入到酵母表面呈現(xiàn)抗體庫中進(jìn)行篩選。為了得到與HA7特異性結(jié)合的抗體,對(duì)抗體庫進(jìn)行兩輪篩選。將兩輪篩選菌液稀釋鋪板,分離單克隆。ELISA方法檢測(cè)抗體與HA7蛋白結(jié)合能力:隨機(jī)挑選30個(gè)單克隆培養(yǎng)、誘導(dǎo),培養(yǎng)上清采用ELISA雙抗夾心法鑒定抗體與HA7的結(jié)合能力。其中與HA7結(jié)合能力最強(qiáng)的抗體的稀釋倍數(shù)為1:200,而其他單克隆的表達(dá)上清最高為1:50,挑選滴度最高的單克隆搖瓶培養(yǎng),protein A純化后用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn),將該抗體命名為N2-2抗體。N2-2抗體結(jié)合HA7蛋白的靶位分析:Western進(jìn)一步驗(yàn)證了N2-2抗體與HA7的結(jié)合情況,但N-糖肽酶PNGase F切除HA7的糖基后發(fā)現(xiàn)N2-2抗體不再與HA7蛋白結(jié)合,提示N2-2抗體的識(shí)別位點(diǎn)位于HA7的糖鏈。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),N2-2抗體與α-甘露糖基修飾的牛核糖核酸酶B,雜合型糖基修飾的昆蟲細(xì)胞表達(dá)的HA7,以及復(fù)雜型糖基修飾的雞胚來源的流感疫苗均不結(jié)合,而與酵母、白色念珠菌裂解物有明顯的結(jié)合,提示其可能作用于真菌特有的糖基,如β-甘露糖,磷酸甘露糖等。Western分析發(fā)現(xiàn),敲除β-甘露糖轉(zhuǎn)移酶ARM1的糖基工程酵母表達(dá)的HA7不與N2-2抗體結(jié)合,提示抗體可能結(jié)合在β-甘露糖上,再利用β-甘露糖苷酶切除HA7的末端甘露糖,Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶切之前66Kb的位置有條帶而酶切之后條帶消失,說明酶切之后的HA7蛋白不再與N2-2抗體有結(jié)合,最終確證N2-2抗體確實(shí)是與HA7糖鏈上的β-甘露糖結(jié)合。N2-2抗體在小鼠體內(nèi)的活性分析:β-甘露糖是真菌特有的糖型,因此,本研究以白色念珠菌為模型,研究N2-2的抗真菌活性。首先Western證實(shí)白色念珠菌裂解物可以與N2-2抗體結(jié)合,然后以Bal B/C小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,首先將白色念珠菌的活菌用生理鹽水進(jìn)行稀釋,配置成濃度為1×107個(gè)/m L、4×107個(gè)/m L、1.6×108個(gè)/m L和6.4×108個(gè)/m L的菌液,將配置好的菌液通過腹腔注射。觀察小鼠的體重變化,確定感染后小鼠體重下降明顯的最佳劑量是4×107個(gè)/m L。將白色念珠菌的菌液配置成4×107個(gè)/m L,將Bal B/C小鼠分成4個(gè)組,分別是生理鹽水組,白色念珠菌組,白色念珠菌+30μg N2-2抗體組和白色念珠菌+15μg N2-2抗體組,其中,兩抗體注射組抗體與白色念珠菌注射液預(yù)混合1h之后腹腔注射小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射了抗體的小鼠體重相比未注射抗體的小鼠,體重回升早,而且回升速度快;而不同劑量的N2-2抗體對(duì)小鼠體重的恢復(fù)也有影響,高劑量組的小鼠體重回升速度更快,恢復(fù)時(shí)間更早,說明N2-2抗體在小鼠體內(nèi)具有一定的抗白色念珠菌活性,且抗菌活性隨抗體用量增加而增加。本研究基于糖基工程酵母表面呈現(xiàn)免疫抗體庫,篩選抗體庫得到特異性針對(duì)β-甘露糖的抗體,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明該抗體在小鼠體內(nèi)具有抗白色念珠菌活性活性。為抗真菌抗體的研究提供了基礎(chǔ)。同時(shí),建立的糖基工程酵母表面呈現(xiàn)抗體庫技術(shù)也可以為其他抗體的篩選提供參考。
【關(guān)鍵詞】：糖基工程酵母 免疫酵母抗體庫 β-甘露糖 中和活性
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.11
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-18
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)材料18-22
• 1.1 質(zhì)粒18
• 1.2 菌株和蛋白18
• 1.3 工具酶、抗體及試劑18-19
• 1.4 主要培養(yǎng)基19
• 1.5 主要溶液19
• 1.6 引物設(shè)計(jì)19-22
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)方法22-32
• 2.1 糖基工程酵母抗體庫的構(gòu)建22-27
• 2.1.1 錨定蛋白表達(dá)載體pGE-AOX-Fc-Sed質(zhì)粒的構(gòu)建22-24
• 2.1.2 抗HA7抗體表達(dá)載體的構(gòu)建24-26
• 2.1.3 糖基工程酵母抗體庫的構(gòu)建26-27
• 2.2 糖基工程酵母抗體庫的篩選27-29
• 2.2.1 羧基免疫磁珠偶聯(lián)HA7蛋白27-28
• 2.2.2 HA7免疫磁珠篩選抗體庫28
• 2.2.3 磁珠篩選的單克隆表達(dá)抗體的活性檢測(cè)28-29
• 2.3 N2-抗體結(jié)合靶點(diǎn)和功能分析29-32
• 2.3.1 N2-2 抗體的表達(dá)和純化29
• 2.3.2 N2-2 抗體結(jié)合的靶點(diǎn)分析29-31
• 2.3.3 N2-2 抗體的功能分析31-32
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-44
• 3.1 糖基工程酵母抗體庫的構(gòu)建32-38
• 3.1.1 錨定蛋白表達(dá)載體pGE-AOX-Fc-Sed質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 3.1.2 抗HA7抗體表達(dá)載體的構(gòu)建33-35
• 3.1.3 糖基工程酵母抗體庫的構(gòu)建35-38
• 3.2 糖基工程酵母抗體庫的篩選38
• 3.3 N2-2 抗體結(jié)合靶點(diǎn)分析38-41
• 3.3.1 PNGase F酶對(duì)糖鏈酶切的分析38-40
• 3.3.2 β-甘露糖苷酶對(duì)糖鏈酶切的分析40-41
• 3.4 N2-2 抗體的活性和功能分析41-44
• 3.4.1 N2-2 抗體對(duì)白色念珠菌的結(jié)合能力41
• 3.4.2 N2-2 抗體對(duì)白色念珠菌的中和活性的檢測(cè)41-44
• 第四部分 結(jié)論44-46
• 第五部分 討論46-50
• 5.1 糖基工程酵母抗體庫的構(gòu)建46-47
• 5.2 抗體庫的免疫磁珠法篩選47
• 5.3 N2-2 抗體靶點(diǎn)測(cè)定和活性檢測(cè)47-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 論著54-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66-68
• 致謝68

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本文編號(hào)：1054160