本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌新人T細(xì)胞表位及特異性蛋白的抗原性研究

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【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis,TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引發(fā)的嚴(yán)重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病。近些年來,由于耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的流行及MTB與人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)共同感染等原因,古老的結(jié)核病再次成為全球面臨的嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。然而,目前診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)依然是羅氏固體培養(yǎng),尚無有效、快速診斷結(jié)核病的方法。同時(shí),研究已證實(shí)BCG的保護(hù)效果不理想,特別是對(duì)成年人結(jié)核幾乎無預(yù)防效果。結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白及其抗原表位的研究,在開發(fā)結(jié)核病新型診斷方法和研究有效的結(jié)核病新疫苗中具有著重要的作用。本研究采用兩種方法開展了結(jié)核分枝桿菌特異性抗原及人T細(xì)胞表位的研究,以期發(fā)現(xiàn)最佳的新T細(xì)胞抗原,為后續(xù)診斷試劑和疫苗研究提供基礎(chǔ)。一方面采用生物信息學(xué)方法,排除PE/PPE家族蛋白、轉(zhuǎn)座子及已知抗原表位,對(duì)余下的所有蛋白進(jìn)行系統(tǒng)、全面的人T細(xì)胞表位預(yù)測(cè),并從中篩選優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行生物合成。合成的表位,采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)斑點(diǎn)法(ELISPOT)進(jìn)行初步及擴(kuò)大樣本量?jī)刹津?yàn)證。同時(shí)對(duì)表位集中的預(yù)測(cè)抗原及已知表位信息的特異性抗原,根據(jù)其編碼基因序列設(shè)計(jì)引物,分子克隆方法獲得重組質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)化入原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),經(jīng)Ni親和柱親和層析方法純化,得到各重組蛋白。若重組蛋白為包涵體表達(dá)形式,采用透析復(fù)性以恢復(fù)天然構(gòu)象。最后,建立最佳血清及抗原濃度的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法,初步評(píng)價(jià)重組蛋白的抗原性。利用TEPredict和IEDB兩個(gè)軟件同時(shí)預(yù)測(cè)出了273個(gè)抗原蛋白的2726個(gè)表位,從中篩選出評(píng)分大于5的50個(gè)表位,主要分布于Rv1798、Rv0197、Rv0658c、Rv2942及Rv3239c 5個(gè)抗原。經(jīng)進(jìn)一步表位優(yōu)化,獲取分布于5個(gè)抗原上的32條多肽,由生物公司合成并純化。采集結(jié)核病人血,分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),ELISPOT方法進(jìn)行初步篩選。經(jīng)10個(gè)細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性病人血樣本對(duì)每條多肽的篩選,獲得6條陽(yáng)性多肽。對(duì)于陽(yáng)性肽再使用50個(gè)細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性的結(jié)核病人及60個(gè)肺部病人和60個(gè)健康人作為對(duì)照進(jìn)行驗(yàn)證。單條肽Rv1798-1、Rv1798-2、Rv0197、Rv0658c、Rv2942、Rv3239c的靈敏度分別為12.0%、18.0%、20.0%、8.0%、10.0%、4.0%,特異度均在99%以上�？乖璕v1798兩條多肽聯(lián)合靈敏度為24.0%,而特異度達(dá)到100%。由此可見,多肽聯(lián)合用于結(jié)核病的診斷價(jià)值,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單條多肽。同時(shí),我們選擇了10個(gè)特異性蛋白抗原進(jìn)行分子克隆及原核表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了相應(yīng)抗原的重組質(zhì)粒,表達(dá)純化得到Gro ES、Lpq H、Pst S3、PPE18、PPE19、Gln A1、Plc A和Ecc A5 8種重組蛋白(其中兩個(gè)重組質(zhì)粒未表達(dá)成功)。進(jìn)一步采用ELISA方法評(píng)價(jià)了這些蛋白在血清學(xué)中的診斷價(jià)值�？乖璆ro ES、PPE18、PPE19、Gln A1及Ecc A5的診斷價(jià)值較高,曲線下面積(AUC)大于80%,其中靈敏度分別為72.1%、76.8%、59.0%、66.8%、66.8%,特異度分別為81.4%、78.4%、92.2%、78.4%、83.3%�？乖璍pq H、Pst S3和Plc A的AUC也均大于70%,其靈敏度分別為66.3%、52.1%、75.3%,特異度分別為68.6%、88.2%、65.7%。綜上所述,本研究首次采用TEPredict和IEDB兩個(gè)軟件同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌毒力相關(guān)抗原進(jìn)行系統(tǒng)全面的人T細(xì)胞表位預(yù)測(cè),驗(yàn)證出6條結(jié)核分枝桿菌人T細(xì)胞表位多肽。同時(shí)通過分子克隆表達(dá)純化和血清學(xué)驗(yàn)證,獲得Gro ES、Lpq H、Pst S3、PPE18、PPE19、Gln A1、Plc A和Ecc A5 8個(gè)具有較好的抗原性蛋白,有望成為結(jié)核感染免疫診斷和新疫苗研究的候選者。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 人T細(xì)胞表位 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) 特異性抗原 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 緒論15-19
• 第2章 T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)、合成及驗(yàn)證19-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 2.1.1 主要試劑與材料19
• 2.1.2 主要的儀器設(shè)備19-20
• 2.1.3 T-SPOT所用全血來源20
• 2.2 方法20-24
• 2.2.1 T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)20-21
• 2.2.2 T細(xì)胞表位合成21
• 2.2.3 ELISPOT酶聯(lián)反應(yīng)斑點(diǎn)法檢測(cè)21-23
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理23-24
• 2.3 結(jié)果24-28
• 2.3.1 表位預(yù)測(cè)24
• 2.3.2 表位合成24-25
• 2.3.3 表位驗(yàn)證25-28
• 2.4 討論28-33
• 第3章 十種特異性蛋白克隆表達(dá)、純化及鑒定33-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33-39
• 3.1.1 菌株、載體33-34
• 3.1.2 主要試劑材料34-35
• 3.1.3 主要溶液及配制35-38
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備38-39
• 3.2 方法39-48
• 3.2.1 目的基因選擇39
• 3.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建39-44
• 3.2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)、純化、復(fù)性及濃度測(cè)定44-46
• 3.2.4 ELISA體液免疫初步檢測(cè)46-48
• 3.3 結(jié)果48-61
• 3.3.1 蛋白抗原編碼基因中的人T/B細(xì)胞表位分布信息48-49
• 3.3.2 十個(gè)蛋白的克隆、表達(dá)、純化及濃度測(cè)定49-59
• 3.3.3 ELISA法檢測(cè)血清中Ig G水平59-61
• 3.4 討論61-65
• 第4章 結(jié)論65-67
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 文獻(xiàn)綜述 T細(xì)胞表位研究及結(jié)核分枝桿菌人T細(xì)胞表位研究進(jìn)展71-85
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果85-87
• 致謝87

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1041712