本文關(guān)鍵詞：弓形蟲棒狀體蛋白R(shí)OP18對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡與分化的影響及機(jī)制研究

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【摘要】：目的探討弓形蟲棒狀體蛋白R(shí)OP18對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡、分化的影響及其機(jī)制。方法(1)將弓形蟲棒狀體蛋白R(shí)OP18從PEGFP-G2-ROP18重組質(zhì)粒上亞克隆至腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP,PCR、測(cè)序鑒定正確的重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP-ROP18,與骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝,收獲、擴(kuò)增重組腺病毒并對(duì)其滴度進(jìn)行測(cè)定。(2)以MOI=70的ROP18重組腺病毒感染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間熒光顯微鏡觀察基因的表達(dá)情況。(3)轉(zhuǎn)染48h后用CCK-8法檢測(cè)C17.2的增殖情況；24h后采用Annexin V-APC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；Western blot法檢測(cè)半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活情況。(4)2%N2+DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)C17.2分化,用ROP18重組腺病毒,空載體腺病毒(MOI=70)干預(yù)細(xì)胞3d,5d后,免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物βⅢ-tubulin的表達(dá)。(5) 2%N2+DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)C17.2分化,用ROP18重組腺病毒,空載體腺病毒(MOI=70)干預(yù)細(xì)胞3d,5d后,收集細(xì)胞,提取總蛋白,采用Western blot法檢測(cè)βⅢ-tubulin水平。(6)2%N2+DMEM/F12培養(yǎng)液誘導(dǎo)C17.2分化,用ROP18重組腺病毒,空載體腺病毒(MOI=70)干預(yù)細(xì)胞3d,5d后,采用Western blot法檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白β-catenin(胞漿和胞核)、Ngnl和Ngn2的表達(dá)水平。用雙熒光素酶試劑盒檢測(cè)Wnt信號(hào)通路的活性結(jié)果(1)重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP-ROP18經(jīng)測(cè)序鑒定,目的DNA序列與靶序列100%吻合。(2)轉(zhuǎn)染48h后用CCK-8檢測(cè)ROP18重組腺病毒組細(xì)胞增殖活力為58.13%±7.373%,較腺病毒對(duì)照組(85.34%±6.092%)及細(xì)胞對(duì)照組(81.51%±3.415%)均有明顯的下降(P0.05)。24h后采用Annexin V-APC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示ROP18重組腺病毒組細(xì)胞凋亡率為31.07%±10.05%,較腺病毒對(duì)照組(2.707%±0.05044%)及細(xì)胞對(duì)照組(0.7775%±0.05250%)均有明顯的下降(P0.001)。Western blot檢測(cè)ROP18重組腺病毒轉(zhuǎn)染組,C17.2神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)的caspase-3蛋白活性片段的表達(dá)量(0.5197±0.06481)較腺病毒空載體對(duì)照(0.1777±0.09308)和細(xì)胞對(duì)照組(0.0340±0.01353)均有明顯升高(P0.05,P0.01)。(3)C17.2細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后3d、5d,免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示ROP18重組腺病毒組神經(jīng)元標(biāo)記蛋白βⅢ-tubulin熒光信號(hào)較誘導(dǎo)分化組明顯減弱。(4) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示分化組,空載體腺病毒組,ROP18重組腺病毒組,在誘導(dǎo)分化后3d βⅢ-tubulin蛋白水平分別為1.563±0.3846,0.7597±0.1081,0.3100±0.09445(P0.05),在誘導(dǎo)分化后5d βⅢ-tubulin蛋白水平分別為1.452±0.2628,0.9057±0.1222,0.4297±0.0845(P0.05)(5)分化組,空載體腺病毒組和ROP18重組腺病毒組在誘導(dǎo)分化后3d檢測(cè)到核內(nèi)β-catenin相對(duì)表達(dá)量分別為1.446±0.4601,0.9670±0.2123,0.3937±0.0318(P0.05),誘導(dǎo)分化后5d的相對(duì)表達(dá)量分別為1.634±0.9286,0.8783±0.1702,0.2807±0.0806(P0.05)。同樣,在誘導(dǎo)分化后3d和5d檢測(cè)胞漿內(nèi)β-catenin相對(duì)表達(dá)量分別為2.362±1.201,0.8263±0.1096,0.3277±0.1294(P0.05)；2.440±0.8909,1.273±0.0602,0.2700±0.0538 (P0.01)。β-catenin下游的靶基因Ngn1, Ngn2的表達(dá)量,ROP18重組腺病毒組(3d為0.8073±0.0700,0.6627±0.1309;5d為0.2213±0.06326,0.3777±0.07826)明顯低于分化組(3d為3.848±1.042,1.890±0.3145；5d為1.825±0.6545,1.714±0.3725)和空載體腺病毒組(3d為1.485±0.1259,1.713±0.1396;5d為1.202±0.2765,1.050±0.2177),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路的活性,ROP18重組腺病毒組TOP/FOP值低于分化組和空載體對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論(1)成功構(gòu)建弓形蟲棒狀體蛋白R(shí)OP18重組腺病毒,且在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)；(2)ROP18重組腺病毒可以誘導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞凋亡;(3)ROP18重組腺病毒可以抑制C17.2神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化；(4)ROP18重組腺病毒可以顯著降低Wnt/β-catenin通路中的關(guān)鍵分子β-catenin的表達(dá)水平,以及下游靶基因Ngnl和Ngn2的表達(dá),并且可以抑制Wnt信號(hào)通路的活性,推測(cè)其可能通過(guò)此信號(hào)通路干預(yù)C17.2分化。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 棒狀體蛋白 ROP18 重組腺病毒 C17.2 神經(jīng)干細(xì)胞 凋亡 分化 Wnt/β-catenin
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R382.5
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照7-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-16
• 2 材料與方法16-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-21
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)蟲株16
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞16
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒16
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要試劑16-17
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)主要試劑的配置17-20
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)主要儀器20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-31
• 2.2.1 弓形蟲在小鼠體內(nèi)的復(fù)蘇、傳達(dá)、收集和凍存21-22
• 2.2.2 C17.2神經(jīng)干細(xì)胞的復(fù)蘇、傳達(dá)、凍存22-23
• 2.2.3 ROP18重組腺病毒的構(gòu)建23-25
• 2.2.4 ROP18重組腺病毒在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞上的表達(dá)25
• 2.2.5 熒光染色(核染)檢測(cè)ROP18重組腺病毒轉(zhuǎn)染至C17.2神干細(xì)胞上后對(duì)細(xì)胞的凋亡影響25
• 2.2.6 CCK-8法檢測(cè)ROP18重組腺病毒轉(zhuǎn)染至C17.2神經(jīng)干細(xì)胞上細(xì)胞的增殖活力25-26
• 2.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROP18重組腺病毒轉(zhuǎn)染至C17.2神干細(xì)胞上后對(duì)細(xì)胞的凋亡影響26-28
• 2.2.8 免疫印跡法檢測(cè)ROP18重組腺病毒對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)中凋亡蛋白表達(dá)的影響28-29
• 2.2.9 免疫印跡法檢測(cè)C17.2神經(jīng)干胞分化中βⅢ-tubulin蛋白及Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)29-30
• 2.2.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)（Luciferase）檢測(cè)Wnt信號(hào)通路活性30
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30-31
• 3 結(jié)果31-41
• 3.1 pHBAd-MCMV-GFP-ROP18重組腺病毒載體的構(gòu)建31-32
• 3.2 ROP18重組腺病毒在C17.2神經(jīng)干細(xì)胞上的表達(dá)32-33
• 3.3 ROP18重組腺病毒對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞起增殖抑制作用33-34
• 3.4 ROP18重組腺病毒對(duì)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞起促凋亡作用34-36
• 3.5 ROP18重組腺病毒抑制C17.2神經(jīng)干細(xì)胞分化36-41
• 3.5.1 ROP18重組腺病毒抑制神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白βⅢ-tubulin的表達(dá)36-38
• 3.5.2 ROP18重組腺病毒抑制Wnt信號(hào)通路活性38-41
• 4 討論41-43
• 5 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 附一 個(gè)人簡(jiǎn)歷47-48
• 附二 致謝48-49
• 附三 綜述49-58
• 參考文獻(xiàn)54-58

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本文編號(hào)：1032222