本文關鍵詞：弓形蟲棒狀體蛋白ROP18對神經干細胞凋亡與分化的影響及機制研究

  更多相關文章： 弓形蟲 棒狀體蛋白 ROP18 重組腺病毒 C17.2 神經干細胞 凋亡 分化 Wnt/β-catenin

【摘要】：目的探討弓形蟲棒狀體蛋白ROP18對神經干細胞凋亡、分化的影響及其機制。方法(1)將弓形蟲棒狀體蛋白ROP18從PEGFP-G2-ROP18重組質粒上亞克隆至腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP,PCR、測序鑒定正確的重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP-ROP18,與骨架質粒pHBAd-BHG共轉染HEK293細胞進行包裝,收獲、擴增重組腺病毒并對其滴度進行測定。(2)以MOI=70的ROP18重組腺病毒感染C17.2神經干細胞,轉染后不同時間熒光顯微鏡觀察基因的表達情況。(3)轉染48h后用CCK-8法檢測C17.2的增殖情況；24h后采用Annexin V-APC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡情況；Western blot法檢測半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的激活情況。(4)2%N2+DMEM/F12培養(yǎng)液誘導C17.2分化,用ROP18重組腺病毒,空載體腺病毒(MOI=70)干預細胞3d,5d后,免疫熒光檢測神經元特異性標志物βⅢ-tubulin的表達。(5) 2%N2+DMEM/F12培養(yǎng)液誘導C17.2分化,用ROP18重組腺病毒,空載體腺病毒(MOI=70)干預細胞3d,5d后,收集細胞,提取總蛋白,采用Western blot法檢測βⅢ-tubulin水平。(6)2%N2+DMEM/F12培養(yǎng)液誘導C17.2分化,用ROP18重組腺病毒,空載體腺病毒(MOI=70)干預細胞3d,5d后,采用Western blot法檢測Wnt信號通路中相關蛋白β-catenin(胞漿和胞核)、Ngnl和Ngn2的表達水平。用雙熒光素酶試劑盒檢測Wnt信號通路的活性結果(1)重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP-ROP18經測序鑒定,目的DNA序列與靶序列100%吻合。(2)轉染48h后用CCK-8檢測ROP18重組腺病毒組細胞增殖活力為58.13%±7.373%,較腺病毒對照組(85.34%±6.092%)及細胞對照組(81.51%±3.415%)均有明顯的下降(P0.05)。24h后采用Annexin V-APC/PI雙染流式細胞術檢測結果顯示ROP18重組腺病毒組細胞凋亡率為31.07%±10.05%,較腺病毒對照組(2.707%±0.05044%)及細胞對照組(0.7775%±0.05250%)均有明顯的下降(P0.001)。Western blot檢測ROP18重組腺病毒轉染組,C17.2神經干細胞內的caspase-3蛋白活性片段的表達量(0.5197±0.06481)較腺病毒空載體對照(0.1777±0.09308)和細胞對照組(0.0340±0.01353)均有明顯升高(P0.05,P0.01)。(3)C17.2細胞在誘導分化后3d、5d,免疫熒光檢測結果顯示ROP18重組腺病毒組神經元標記蛋白βⅢ-tubulin熒光信號較誘導分化組明顯減弱。(4) Western blotting檢測結果顯示分化組,空載體腺病毒組,ROP18重組腺病毒組,在誘導分化后3d βⅢ-tubulin蛋白水平分別為1.563±0.3846,0.7597±0.1081,0.3100±0.09445(P0.05),在誘導分化后5d βⅢ-tubulin蛋白水平分別為1.452±0.2628,0.9057±0.1222,0.4297±0.0845(P0.05)(5)分化組,空載體腺病毒組和ROP18重組腺病毒組在誘導分化后3d檢測到核內β-catenin相對表達量分別為1.446±0.4601,0.9670±0.2123,0.3937±0.0318(P0.05),誘導分化后5d的相對表達量分別為1.634±0.9286,0.8783±0.1702,0.2807±0.0806(P0.05)。同樣,在誘導分化后3d和5d檢測胞漿內β-catenin相對表達量分別為2.362±1.201,0.8263±0.1096,0.3277±0.1294(P0.05)；2.440±0.8909,1.273±0.0602,0.2700±0.0538 (P0.01)。β-catenin下游的靶基因Ngn1, Ngn2的表達量,ROP18重組腺病毒組(3d為0.8073±0.0700,0.6627±0.1309;5d為0.2213±0.06326,0.3777±0.07826)明顯低于分化組(3d為3.848±1.042,1.890±0.3145；5d為1.825±0.6545,1.714±0.3725)和空載體腺病毒組(3d為1.485±0.1259,1.713±0.1396;5d為1.202±0.2765,1.050±0.2177),差異具有統計學意義。雙熒光素酶實驗檢測Wnt信號通路的活性,ROP18重組腺病毒組TOP/FOP值低于分化組和空載體對照組(P0.05)。結論(1)成功構建弓形蟲棒狀體蛋白ROP18重組腺病毒,且在C17.2神經干細胞中表達；(2)ROP18重組腺病毒可以誘導C17.2神經干細胞凋亡;(3)ROP18重組腺病毒可以抑制C17.2神經干細胞向神經元的分化；(4)ROP18重組腺病毒可以顯著降低Wnt/β-catenin通路中的關鍵分子β-catenin的表達水平,以及下游靶基因Ngnl和Ngn2的表達,并且可以抑制Wnt信號通路的活性,推測其可能通過此信號通路干預C17.2分化。
【關鍵詞】：弓形蟲 棒狀體蛋白 ROP18 重組腺病毒 C17.2 神經干細胞 凋亡 分化 Wnt/β-catenin
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照7-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-16
• 2 材料與方法16-31
• 2.1 實驗材料16-21
• 2.1.1 實驗動物16
• 2.1.2 實驗蟲株16
• 2.1.3 實驗細胞16
• 2.1.4 實驗質粒16
• 2.1.5 實驗主要試劑16-17
• 2.1.6 實驗主要試劑的配置17-20
• 2.1.7 實驗主要儀器20-21
• 2.2 實驗方法21-31
• 2.2.1 弓形蟲在小鼠體內的復蘇、傳達、收集和凍存21-22
• 2.2.2 C17.2神經干細胞的復蘇、傳達、凍存22-23
• 2.2.3 ROP18重組腺病毒的構建23-25
• 2.2.4 ROP18重組腺病毒在C17.2神經干細胞上的表達25
• 2.2.5 熒光染色(核染)檢測ROP18重組腺病毒轉染至C17.2神干細胞上后對細胞的凋亡影響25
• 2.2.6 CCK-8法檢測ROP18重組腺病毒轉染至C17.2神經干細胞上細胞的增殖活力25-26
• 2.2.7 流式細胞術檢測ROP18重組腺病毒轉染至C17.2神干細胞上后對細胞的凋亡影響26-28
• 2.2.8 免疫印跡法檢測ROP18重組腺病毒對C17.2神經干細中凋亡蛋白表達的影響28-29
• 2.2.9 免疫印跡法檢測C17.2神經干胞分化中βⅢ-tubulin蛋白及Wnt信號通路中相關蛋白的表達29-30
• 2.2.10 雙熒光素酶實驗（Luciferase）檢測Wnt信號通路活性30
• 2.2.11 統計學分析30-31
• 3 結果31-41
• 3.1 pHBAd-MCMV-GFP-ROP18重組腺病毒載體的構建31-32
• 3.2 ROP18重組腺病毒在C17.2神經干細胞上的表達32-33
• 3.3 ROP18重組腺病毒對C17.2神經干細胞起增殖抑制作用33-34
• 3.4 ROP18重組腺病毒對C17.2神經干細胞起促凋亡作用34-36
• 3.5 ROP18重組腺病毒抑制C17.2神經干細胞分化36-41
• 3.5.1 ROP18重組腺病毒抑制神經元特異性標志蛋白βⅢ-tubulin的表達36-38
• 3.5.2 ROP18重組腺病毒抑制Wnt信號通路活性38-41
• 4 討論41-43
• 5 結論43-44
• 參考文獻44-47
• 附一 個人簡歷47-48
• 附二 致謝48-49
• 附三 綜述49-58
• 參考文獻54-58

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