本文關(guān)鍵詞：重組慢病毒載體介導(dǎo)KSHV分子開關(guān)蛋白Rta在BCBL-1細(xì)胞中的表達(dá)及其功能鑒定

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【摘要】：目的:構(gòu)建含卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)分子開關(guān)蛋白,即復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白(replication and transcriptional activator,Rta)基因的重組慢病毒載體。方法:從真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Rta中擴(kuò)增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中,構(gòu)建重組慢病毒載體pHAGE-Rta。將重組慢病毒骨架質(zhì)粒pHAGE-Rta與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察表達(dá)綠色熒光蛋白的293 T細(xì)胞占總數(shù)的百分比。收集病毒懸液,采用梯度稀釋法測定病毒滴度。以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的Lentivirus-Rta病毒量感染BCBL-1細(xì)胞,72 h后檢測Rta基因的表達(dá),同時通過蛋白質(zhì)印跡和病毒顆粒釋放實(shí)驗(yàn)檢測KSHV裂解期蛋白病毒白細(xì)胞介素-6(vIL-6)的表達(dá)及子代病毒顆粒的產(chǎn)出。結(jié)果:從真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Rta中擴(kuò)增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen后,酶切鑒定和核酸序列測定證實(shí)重組慢病毒骨架質(zhì)粒pHAGE-Rta構(gòu)建成功。通過慢病毒包裝3質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)獲得了表達(dá)Rta基因的重組慢病毒,滴度約為2×107efu/mL。以不同MOI的重組慢病毒感染BCBL-1細(xì)胞,72 h后可檢測到外源基因編碼Rta蛋白的表達(dá),且其表達(dá)能夠上調(diào)KSHV vIL-6的表達(dá)水平及促進(jìn)子代病毒顆粒的釋放。結(jié)論:成功構(gòu)建了含Rta基因的慢病毒表達(dá)載體,獲得的重組病毒能夠有效地感染BCBL-1細(xì)胞,并發(fā)揮激活KSHV裂解期復(fù)制的生物學(xué)功能。
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)系;
【關(guān)鍵詞】： 慢病毒 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白 卡波氏肉瘤病毒 病毒復(fù)制
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371824)
【分類號】：R373
【正文快照】： 人類皰疹病毒8型又稱為卡波氏肉瘤病毒(Ka-posi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),是一種與卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS),多中心卡斯特萊曼病和原發(fā)性滲出性淋巴瘤(primary effusionlymphoma,PEL),即體腔滲出性淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)的發(fā)生高度

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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【相似文獻(xiàn)】

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7 孫強(qiáng)明;潘s，

本文編號：1013583