本文關(guān)鍵詞：沙眼衣原體pORF5質(zhì)粒蛋白對HeLa細(xì)胞自噬與凋亡的影響

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【摘要】：目的：自噬和凋亡是決定細(xì)胞命運的重要因素,參與各種疾病的病理和生理過程。盡管隨著研究的不斷深入對自噬與凋亡的調(diào)控機制已經(jīng)取得了重要進(jìn)展,但關(guān)于沙眼衣原體引起的自噬和凋亡的具體調(diào)控機制尚未清楚。本研究試圖探討沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pORF5對HeLa細(xì)胞自噬和凋亡的影響,為進(jìn)一步闡明沙眼衣原體的致病機制提供實驗依據(jù)。方法：將pDSRed C1/pORF5重組菌接種在LB固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h,挑取單個菌落,轉(zhuǎn)種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4h；按照OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取pDSRed C1/pORF5重組質(zhì)粒；用含NheI、EcoRI酶切位點的pORF5特異性引物擴增pORF5基因,再分別雙酶切PCR擴增產(chǎn)物和慢病毒表達(dá)載體DCE(PCDH-CMV-MCS-EF1-COPGFP);酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a,然后進(jìn)行菌落PCR、雙酶切及測序鑒定；高純度無內(nèi)毒素抽提慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒后,與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后8h更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,上清濃縮后得到高滴度的慢病毒顆粒,采用倍比稀釋法檢測病毒滴度；慢病毒感染HeLa細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察感染情況；流式分選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa;間接免疫熒光方法和Western blot方法鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中pORF5的表達(dá)；血清饑餓處理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa細(xì)胞24h,qRT-PCR、Western blot和間接免疫熒光檢測LC3(mi crotubule-associated proteinl light chain3)、Becinl的表達(dá)水平；TNF-α處理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均用血清饑餓和3-MA分別處理,RT-PCR檢測細(xì)胞Bax和Caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果：1、成功建立DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,經(jīng)過流式分選穩(wěn)轉(zhuǎn)株純度達(dá)95%以上。2、間接免疫熒光結(jié)果顯示,饑餓處理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均出現(xiàn)LC3紅色熒光斑點,定量后分別為(34.0±2.6個/細(xì)胞)和(97.6±12.1個/細(xì)胞),且DCE-pORF5-HeLa較DCE-HeLa點狀熒光斑點明顯增多(P0.05)。3、血清饑餓處理的DCE-HeLa細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3I比率和Beclinl蛋白表達(dá)水平比未處理組分別增加了56.0%(P0.01)和57.8%(P0.01)；血清饑餓組處理的DCE-pORF5-HeLa中LC3-Ⅱ/LC3I比率和Beclin1的蛋白表達(dá)水平比未處理組分別增加了87.2%(P0.01)和76.6%(P0.01)；饑餓處理的DCE-pORF5-HeLa中 LC3-Ⅱ/LC3I比率和Beclinl的表達(dá)水平比同處理的DCE-HeLa分別升高了53.3%(P0.01)和28.7%(P0.05)。4、饑餓處理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的mRNA表達(dá)水平較同處理的DCE-HeLa分別降低47.6%和25.7%(P0.05),3-MA處理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的表達(dá)mRNA水平較同處理的DCE-HeLa分別低73.0%和43.6%(P0.05)5、未處理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa細(xì)胞的凋亡率均低于5%,而TNF-a處理后6h后,DCE-pORF5-HeLa的凋亡率達(dá)為(44.4±6.0)%,對照組DCE-HeLa細(xì)胞凋亡率為(62.9±0.8)%,DCE-pORF5-HeLa凋亡率比DCE-HeLa細(xì)胞降低了29.4%(P0.05)結(jié)論：1、pORF5質(zhì)粒蛋白可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬。2, pORF5質(zhì)粒蛋白可抑制HeLa細(xì)胞凋亡,機制與其誘導(dǎo)的自噬有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：沙眼衣原體 質(zhì)粒蛋白pORF5 自噬 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R374.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-15
• 第二章 實驗材料15-19
• 2.1 主要實驗儀器15
• 2.2 載體、菌株及細(xì)胞株15-19
• 第三章 實驗方法19-39
• 3.1 pDSRed C1/pORF5真核表達(dá)重組質(zhì)粒的提取與鑒定19-21
• 3.2 重組慢病毒的制備21-27
• 3.3 DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立27-31
• 3.4 pORF5質(zhì)粒蛋白與HeLa細(xì)胞自噬的關(guān)系31-35
• 3.5 pORF5對HeLa細(xì)胞凋亡的影響35-36
• 3.6 pORF5誘導(dǎo)的自噬對HeLa細(xì)胞凋亡的影響36-37
• 3.7 統(tǒng)計學(xué)分析37-39
• 第四章 實驗結(jié)果39-55
• 4.1 pDSRed C1/pORF5真核表達(dá)載體的鑒定39
• 4.2 pORF5慢病毒表達(dá)載體的鑒定39-42
• 4.3 pORF5基因慢病毒的包裝和純化42-44
• 4.4 pORF5基因慢病毒感染HeLa細(xì)胞44-46
• 4.5 DCE-pORF5-HeLa細(xì)胞中pORF5質(zhì)粒蛋白表達(dá)的鑒定46-47
• 4.6 饑餓對細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)的影響47-51
• 4.7 Real-Time PCR檢測細(xì)胞饑餓處理與3-MA處理后的凋亡情況51-52
• 4.8 pORF5對HeLa細(xì)胞凋亡的影響52-55
• 第五章 討論55-61
• 第六章 結(jié)論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 綜述67-77
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 本研究受以下基金資助77-79
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果79-81
• 致謝81

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本文編號：972931