本文關(guān)鍵詞：豬胚胎來源干細胞建系方法的初步研究

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【摘要】：哺乳動物胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESC)和滋養(yǎng)層干細胞(trophoblast stem cells, TSC)均屬于胚胎來源的干細胞,由早期胚胎或內(nèi)細胞團(inner cell mass, ICM)培養(yǎng)而來。胚胎干細胞已經(jīng)在小鼠、人、猴子和大鼠上成功建系,滋養(yǎng)層干細胞也已經(jīng)在小鼠、人、兔子和猴上成功建立。但無論是胚胎干細胞還是滋養(yǎng)層干細胞,在有蹄類大動物上均未取得成功。由于豬在體型和相關(guān)生理功能方面都與人類十分接近,所以豬胚胎干細胞和滋養(yǎng)層干細胞是研究人類相關(guān)基因疾病以及異種移植的最佳模型。本研究初步摸索豬滋養(yǎng)層干細胞的建系方法；同時構(gòu)建高表達白血病抑制因子(leukemia inhibitor factors,LIF)的飼養(yǎng)層細胞,并構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子表達載體,以期提高豬胚胎干細胞的質(zhì)量及建系效率。目的通過接種體外受精囊胚,建立豬滋養(yǎng)層干細胞系；建立高效表達豬LIF的STO細胞系,優(yōu)化豬胚胎干細胞的培養(yǎng)條件；構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子表達載體,輔助豬胚胎干細胞建系。方法1.通過接種體外受精囊胚,建立豬滋養(yǎng)層干細胞系：通過體外受精和發(fā)育培養(yǎng)獲得第6天囊胚,去除透明帶后將全胚接種于STO飼養(yǎng)層上,用FGF系統(tǒng)干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)滋養(yǎng)層干細胞,并利用機械切割的方法進行傳代,通過形態(tài)學和堿性磷酸酶染色方法鑒定其干細胞特性。2.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的技術(shù),將已構(gòu)建的豬LIF基因真核表達載體pCAG-pLIF轉(zhuǎn)染至小鼠STO細胞中,通過藥物篩選獲得能夠穩(wěn)定表達豬LIF的轉(zhuǎn)基因STO細胞(STO-pLIF細胞)。通過QPCR、Western blot等方法檢測STO-pLIF細胞中豬LIF的表達量。選擇高效表達豬LIF的STO-pLIF細胞作為飼養(yǎng)層,培養(yǎng)大鼠誘導多能性干細胞(induced pluripotency stem cells, iPS)。通過生長曲線檢測、堿性磷酸酶染色、干細胞多能因子的RT-PCR檢測和免疫熒光染色等方法,檢驗STO-pLIF細胞飼養(yǎng)層在大鼠iPS細胞培養(yǎng)方面的功能。3.以豬胚胎成纖維細胞(pig embryonic fibroblast, PEF)的cDNA為模板,合成或擴增豬源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5五個轉(zhuǎn)錄因子,利用PCR方法,將REX1、LIN28、DPPA5以E2A和T2A序列連接成3因子片段并通過測序檢測其準確性,將商業(yè)構(gòu)建的OCT4和TBX3以及自行構(gòu)建的三因子片段分別經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切后連接到誘導表達載體pTRE3G-ZsGreenI中,獲得三個重組表達載體。為了驗證所構(gòu)建質(zhì)粒功能,將豬源OCT4重組表達載體和pEF1a-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入PEF細胞中,并在細胞培養(yǎng)時添加強力霉素(DOX)誘導外源轉(zhuǎn)錄因子表達,通過QPCR檢測載體中豬源OCT4的表達情況。結(jié)果1.所建立的滋養(yǎng)層干細胞系最高傳代至第9代,逐漸出現(xiàn)較多油滴,無法繼續(xù)傳代；由于傳代受限,無法有效擴增細胞系,后續(xù)的核型鑒定和堿性磷酸酶染色結(jié)果均不理想。2.獲得豬LIF轉(zhuǎn)基因陽性STO細胞系,STO-pLIF細胞中LIF基因和蛋白的表達量均有上調(diào)；該細胞系作為飼養(yǎng)層所培養(yǎng)的大鼠iPS細胞在形態(tài)、多能性因子表達方面更接近于含LIF的傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的大鼠iPS細胞,顯著優(yōu)于無外源LIF添加的培養(yǎng)液所培養(yǎng)的大鼠iPS細胞。3.成功構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子重組表達載體,在豬源OCT4重組表達載體與pEF1a-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PEF細胞并經(jīng)DOX誘導表達后,利用QPCR檢測發(fā)現(xiàn)其有效提高了PEF細胞中OCT4轉(zhuǎn)錄因子的表達量。結(jié)論1.盡管接種體外受精囊胚能夠形成滋養(yǎng)層干細胞,但是由于培養(yǎng)條件、傳代方法等問題仍然無法穩(wěn)定傳代,還需進一步優(yōu)化方法。2.成功獲得了穩(wěn)定表達豬LIF基因的STO-pLIF細胞,并證明該細胞作為飼養(yǎng)層在大鼠iPS細胞培養(yǎng)中具有一定優(yōu)勢。3.成功構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子的重組表達載體,將進一步利用其轉(zhuǎn)染的PEF細胞誘導形成iPS細胞或輔助建立豬胚胎干細胞系。
【關(guān)鍵詞】：豬滋養(yǎng)層干細胞 白血病抑制因子 STO細胞 重組誘導表達載體 豬源轉(zhuǎn)錄因子
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 第一部分 建立豬滋養(yǎng)層干細胞系12-34
• 前言12-13
• 材料與方法13-25
• 結(jié)果25-30
• 討論30-32
• 參考文獻32-34
• 第二部分 建立穩(wěn)定表達豬LIF蛋白的小鼠STO細胞系34-59
• 前言34-36
• 材料與方法36-48
• 實驗結(jié)果48-54
• 討論54-57
• 參考文獻57-59
• 第三部分 構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子重組表達載體59-79
• 前言59-61
• 材料與方法61-69
• 實驗結(jié)果69-76
• 討論76-77
• 參考文獻77-79
• 綜述部分79-85
• 參考文獻83-85
• 全文主要縮略語85-87
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況及科研工作情況87-88
• 致謝88-89

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊寧;趙麗華;張曼玲;金永;侯道榮;吳兆強;陳袁;李榮鳳;;建立高效表達豬LIF的豬胚胎成纖維細胞系[J];中國細胞生物學學報;2015年07期

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本文編號：953761