本文關(guān)鍵詞：活細(xì)胞微絲骨架和spectrin連接蛋白結(jié)構(gòu)張力的識(shí)別及其調(diào)控機(jī)制分析

  更多相關(guān)文章： cpstFRET actin spectrin talin 瘢痕抑制因子 軸突再生 藥物

【摘要】：目的：力學(xué)信號(hào)是與化學(xué)、電信號(hào)同樣重要的活細(xì)胞調(diào)控因素。基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理,我們構(gòu)建了熒光蛋白cpstFRET模塊,嵌入actin和spectrin結(jié)構(gòu)蛋白中,將骨架結(jié)構(gòu)張力轉(zhuǎn)換為光學(xué)信號(hào),旨在揭示胞內(nèi)張力在維持細(xì)胞生命活動(dòng)和調(diào)控神經(jīng)元極化和軸突生長(zhǎng)再生所發(fā)揮的作用。方法：基于FRET原理和分子克隆技術(shù),改造Cerulean和Venus熒光蛋白并構(gòu)建成cpstFRET模塊,分別插入兩個(gè)β-actin基因之間和單分子spectrin基因內(nèi)構(gòu)建成AcpA和spectrinM張力探針。將兩個(gè)張力探針分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),并整合到微絲和spectrin蛋白內(nèi)。當(dāng)Actin束或spectrin蛋白結(jié)構(gòu)張力發(fā)生改變,能導(dǎo)致FRET供受體間的角度從平行轉(zhuǎn)向垂直,FRET效率降低,結(jié)構(gòu)張力變化轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷墓鈱W(xué)信號(hào)。采用激光共聚焦FRAP/FLIP技術(shù)、3D掃描模塊以及低滲(ddH2O)、IP3受體激動(dòng)劑(Caffeine)刺激等手段驗(yàn)證探針有效性。AcpA探針在PC12細(xì)胞系中表達(dá)后,結(jié)合pEGFP-C 1-talin、pcDNA3.1 (+)-E-cadherin質(zhì)粒,β-NGF、膠質(zhì)瘢痕抑制因子等藥物建立神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)或再生抑制的體外微絲張力檢測(cè)模型,用于檢測(cè)talin和E-cadherin在軸突生長(zhǎng)中的作用。最后,在MCF-7細(xì)胞系中表達(dá)兩種探針,檢測(cè)藥物維拉帕米、長(zhǎng)春堿、喜樹堿和紫杉醇分別對(duì)actin束和spectrin蛋白結(jié)構(gòu)張力的影響,闡明不同藥物誘導(dǎo)下骨架結(jié)構(gòu)蛋白的力學(xué)效應(yīng)。結(jié)果：基于FRET原理構(gòu)建的基因編碼熒光張力檢測(cè)探針AcpA和SpectrinM可實(shí)時(shí)測(cè)定活細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)張力變化。低滲和caffeine刺激均能使actin和spectrin蛋白結(jié)構(gòu)張力增強(qiáng)。神經(jīng)元細(xì)胞中,神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)可上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞胞內(nèi)結(jié)構(gòu)張力,而瘢痕抑制因子aggrecan和CSPG能減弱胞內(nèi)結(jié)構(gòu)力強(qiáng)度；在NGF刺激的PC12細(xì)胞內(nèi),神經(jīng)元軸突內(nèi)張力顯著高于胞體；此外,talin能上調(diào)胞內(nèi)微絲張力,正向調(diào)控軸突生長(zhǎng)；瘢痕抑制因子和E-cadherin下調(diào)胞內(nèi)微絲張力,負(fù)向調(diào)控軸突再生。Talin也可以部分逆轉(zhuǎn)瘢痕抑制因子對(duì)軸突再生的抑制。鈣通道阻滯劑維拉帕米可以提高細(xì)胞內(nèi)actin和spectrin蛋白結(jié)構(gòu)張力；喜樹堿誘導(dǎo)下,actin束和spectrin蛋白張力均顯著增強(qiáng)；微管蛋白特異性藥物長(zhǎng)春堿和紫杉醇誘導(dǎo)微絲蛋白張力顯著增強(qiáng),而spectrin蛋白張力小幅增長(zhǎng)后又逐漸恢復(fù)正常水平。結(jié)論：胞內(nèi)張力信號(hào)參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)調(diào)節(jié),如神經(jīng)元極化、軸突再生、細(xì)胞凋亡和形態(tài)穩(wěn)定等。Talin過表達(dá)能上調(diào)神經(jīng)元胞內(nèi)微絲張力,而微絲張力增強(qiáng)對(duì)神經(jīng)元分化和軸突延伸有促進(jìn)作用。細(xì)胞可通過Ca2+依賴的方式上調(diào)微絲骨架和spectrin蛋白張力,但Ca2+濃度降低不一定會(huì)導(dǎo)致actin和spectrin蛋白張力的降低。微管功能抑制后,微絲骨架張力可能部分彌補(bǔ)微管功能缺失,維持細(xì)胞正常生理。本研究揭示了微絲張力和spectrin蛋白牽拉力對(duì)細(xì)胞形態(tài)和生理活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制,為探明細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)張力活動(dòng)提供新的檢測(cè)工具和有效的研究方法。
【關(guān)鍵詞】：cpstFRET actin spectrin talin 瘢痕抑制因子 軸突再生 藥物
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-40
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料與試劑15-18
• 1.1 儀器設(shè)備15-16
• 1.2 試劑來源16-18
• 2. 研究方法18-40
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)18
• 2.2 咖啡因及其他藥物配制18-19
• 2.3 cDNA克隆和探針構(gòu)建19-21
• 2.3.1. 探針構(gòu)建原理19-20
• 2.3.2. 探針質(zhì)粒的構(gòu)建20
• 2.3.3. 定量和半定量評(píng)估20-21
• 2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增和提取21-25
• 2.4.1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增21-23
• 2.4.2. 質(zhì)粒提取23-25
• 2.4.3. 質(zhì)粒濃度測(cè)量25
• 2.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及共轉(zhuǎn)染25-26
• 2.5.1. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染25-26
• 2.5.2. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染26
• 2.6 蛋白質(zhì)提取和濃度測(cè)量26-27
• 2.6.1. 總蛋白的提取26-27
• 2.6.2. 蛋白含量的測(cè)量——BCA法27
• 2.7 免疫熒光27-28
• 2.8 總RNA提取28-30
• 2.8.1. 總RNA提取28-29
• 2.8.2. RNA濃度測(cè)量29
• 2.8.3. 瓊脂糖凝膠電泳29-30
• 2.9 PCR30-33
• 2.9.1 逆轉(zhuǎn)錄30-31
• 2.9.2. PCR擴(kuò)增目的序列31-32
• 2.9.3. 目的片段純化32-33
• 2.10 酶切和連接33-34
• 2.10.1. 雙酶切33
• 2.10.2. 連接33-34
• 2.11 激光共聚焦34-39
• 2.11.1. FRET SE34-36
• 2.11.2. FRET AB36-37
• 2.11.3. FRAP37-39
• 2.12 數(shù)據(jù)處理39-40
• 結(jié)果40-47
• 第一部分 熒光張力探針設(shè)計(jì)及有效性檢測(cè)40-42
• 1、cpstFRET模塊和actin、spectrin熒光張力檢測(cè)探針構(gòu)建40
• 2、FRAP和FLIP驗(yàn)證探針有效性和準(zhǔn)確性40-41
• 3、actinM和spectrinM探針的3D成像41
• 4、低滲條件下滲透壓對(duì)actin蛋白的影響41-42
• 5、鈣信號(hào)對(duì)微絲張力及Spectrin牽拉力的作用42
• 第二部分 微絲張力調(diào)控神經(jīng)元極化、軸突生長(zhǎng)和再生機(jī)制42-44
• 1、NGF通過talin上調(diào)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)張力,促進(jìn)神經(jīng)元極化和軸突生長(zhǎng)42-43
• 2、膠質(zhì)瘢痕抑制因子和E-cadherin部分下調(diào)微絲張力,抑制軸突生長(zhǎng)和再生43-44
• 3、Talin/vinculin和瘢痕抑制因子調(diào)控神經(jīng)元胞內(nèi)張力機(jī)制44
• 第三部分 抗腫瘤藥物對(duì)actin和spectrin蛋白機(jī)械應(yīng)力的作用研究44-47
• 1、維拉帕米44-45
• 2、長(zhǎng)春堿45
• 3、喜樹堿45-46
• 4、紫杉醇46-47
• 討論47-51
• 小結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及中文注釋57-66
• 附錄(一) 綜述66-88
• 參考文獻(xiàn)83-88
• 附錄(二) 縮略詞表88-90
• 附錄(三) 發(fā)表文章90
• 附錄(四) 獲得的榮譽(yù)90-91
• 附錄(五) 致謝91

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本文編號(hào)：945059