本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌Hsp65-Esat6與hGM-CSF聯(lián)合DNA疫苗的構(gòu)建與體外研究

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【摘要】：目的:應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建p IHsp65-Esat6GM共表達(dá)質(zhì)粒,并在真核細(xì)胞中表達(dá).方法:以p EGHsp65Esat-6為模板經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增出Hsp65-Esat6基因,同時從質(zhì)粒p ORF-h GM-CSF中擴(kuò)增出基因佐劑h GM-CSF,分別克隆到真核表達(dá)載體p IRES的多克隆位點(diǎn)A(MCSA)和B(MCSB)中,構(gòu)建p IHsp65-Esat6GM共表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染Hep G-2細(xì)胞中表達(dá)和檢測.結(jié)果:酶切鑒定提示插入的基因片段大小分別為1.93 kb和0.47kb,測序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列與Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt檢測到Hsp65-Esat6融合蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)為75 000 k Da;RT-PCR方法檢測出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均有h GM-CSF mRNA表達(dá),三組細(xì)胞中h GM-CSF基因mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05).ELISA方法檢測到p IHsp65-Esat6GM轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中h GM-CSF的表達(dá),且與空載體對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01).結(jié)論:成功構(gòu)建和表達(dá)了p IHsp65-Esat6GM質(zhì)粒,為研制優(yōu)于卡介苗(BCG)的新型抗結(jié)核病的DNA疫苗奠定了基礎(chǔ).
【作者單位】： 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室;
【關(guān)鍵詞】： 熱休克蛋白kd-早期分泌性抗原靶kd 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 雙順反子 基因佐劑
【基金】：國家“十二五”科技重大專項(xiàng)(2014ZX10003002;2012ZX10004903)
【分類號】：R392
【正文快照】： 結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的傳染性疾病,每年全球大約有一百五十萬人死于結(jié)核病,并且每年有接近九百萬的新增病例[1].卡介苗(ba-cille calmette-guerin,BCG)是目前被廣泛用于預(yù)防結(jié)核病的減毒活疫苗,但其免疫效果仍不

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