本文關(guān)鍵詞：DYRK蛋白激酶調(diào)控TGF-β信號(hào)通路的功能與機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) TGF-β DYRKs E3泛素化復(fù)合物 磷酸化

【摘要】：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)是一類(lèi)多功能的細(xì)胞因子,能調(diào)控多種類(lèi)型細(xì)胞的增殖、分化與凋亡,調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和胚胎發(fā)育等過(guò)程,在多種疾病中發(fā)揮重要作用。以腫瘤為例,在其發(fā)展初期,TGF-β通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的分化、凋亡等過(guò)程抑制腫瘤進(jìn)展；后期腫瘤中,TGF-β則通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化、誘導(dǎo)腫瘤血管生成和協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸等過(guò)程,導(dǎo)致腫瘤的惡化。TGF-β在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用相當(dāng)關(guān)鍵,但對(duì)TGF-β信號(hào)是如何受到環(huán)境和遺傳等因素的調(diào)控,目前仍舊所知甚少,值得進(jìn)一步探索。通過(guò)對(duì)人全激酶的功能蛋白組學(xué)篩選,我們發(fā)現(xiàn)雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)控激酶(DYRKs),依賴(lài)其絲蘇氨酸激酶活性,通過(guò)介導(dǎo)Smad3的泛素化修飾,反向調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路。生化分析表明,DYRK蛋白激酶直接磷酸化Smad3 Linker區(qū)域的Thr179殘基,導(dǎo)致Smad3通過(guò)與底物識(shí)別蛋白VPRBP結(jié)合,并在DDB1的作用下,招募EDD E3連接酶。VPRBP-DDB1-EDD (EDVP)復(fù)合物進(jìn)而泛素化修飾Smad3,阻斷Smad3與啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄共激活子的結(jié)合,從而抑制TGF-p信號(hào)通路的活化。另外,敲減VPRBP、DDB1或用小分子抑制劑INDY抑制DYRK蛋白激酶的活性,將會(huì)促進(jìn)TGF-β/Smad信號(hào)通路的活化。這些結(jié)果表明,DYRK蛋白激酶誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化及后續(xù)EDVP E3復(fù)合物的招募對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)有較為顯著的影響。因此,我們的研究鑒定了TGF-β/Smad信號(hào)與功能的新的調(diào)控因子,也闡述了其調(diào)控的分子機(jī)制,這對(duì)于理解TGF-β這一關(guān)鍵細(xì)胞通路有較為重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) TGF-β DYRKs E3泛素化復(fù)合物 磷酸化
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1.1 TGF-β信號(hào)通路及信號(hào)調(diào)控12-18
• 1.1.1 TGF-β超家族12-13
• 1.1.2 TGF-β信號(hào)通路13-15
• 1.1.3 TGF-β信號(hào)通路的功能15-16
• 1.1.4 TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控16-18
• 1.2 蛋白激酶18-19
• 1.3 DYRK蛋白激酶19-22
• 1.3.1 DYRK蛋白激酶的結(jié)構(gòu)19-21
• 1.3.2 DYRK蛋白激酶的功能21-22
• 1.4 泛素化修飾及功能調(diào)控22-23
• 1.5 EDVP復(fù)合物23-25
• 2 材料與方法25-44
• 2.1 材料25-29
• 2.1.1 細(xì)胞系與菌株25
• 2.1.2 主要的抗體25-26
• 2.1.3 主要試劑26-27
• 2.1.4 常規(guī)溶液配制27-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器29-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法31-44
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)31-32
• 2.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染32-33
• 2.3.3 Western blot技術(shù)33-34
• 2.3.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)34
• 2.3.5 免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)34-35
• 2.3.6 體外激酶反應(yīng)35-36
• 2.3.7 γ-S體外激酶反應(yīng)36-37
• 2.3.8 siRNA技術(shù)37-38
• 2.3.9 DNA Pull-Down38-39
• 2.3.10 質(zhì)粒構(gòu)建39-41
• 2.3.11 大腸桿菌轉(zhuǎn)化41
• 2.3.12 定點(diǎn)突變技術(shù)41-42
• 2.3.13 Real-Time PCR技術(shù)42-44
• 3 結(jié)果與分析44-69
• 3.1 DYRK蛋白激酶負(fù)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路44-49
• 3.1.1 DYRK蛋白激酶比較顯著地抑制TGF-β信號(hào)通路44-45
• 3.1.2 DYRK蛋白激酶抑制TGF-β信號(hào)通路依賴(lài)于它們的激酶活性45-47
• 3.1.3 敲低DYRK蛋白激酶將增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路47-49
• 3.2 DYRK蛋白激酶與Smad3相互作用形成復(fù)合體49-51
• 3.3 DYRK蛋白激酶直接磷酸化修飾Smad351-57
• 3.3.1 DYRK蛋白激酶在細(xì)胞內(nèi)或體外磷酸化修飾Smad3的多個(gè)位點(diǎn)51-53
• 3.3.2 DYRK蛋白激酶磷酸化修飾Smad3的Thr132和Thr179殘基53-55
• 3.3.3 DYRK蛋白激酶在細(xì)胞內(nèi)和體外均促進(jìn)Smad3的C端SXS位點(diǎn)的磷酸化55-57
• 3.4. DYRK蛋白激酶介導(dǎo)的修飾阻斷Smad3與啟動(dòng)子結(jié)合57-61
• 3.4.1 DYRK蛋白激酶促進(jìn)Smad3：Smad4復(fù)合物的形成57-59
• 3.4.2 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)表明DYRK2促進(jìn)Smad3的入核59-60
• 3.4.3 DYRK2減弱Smad3與轉(zhuǎn)錄共激活子p300的結(jié)合60-61
• 3.4.4 DYRK2減弱Smad3結(jié)合DNA的能力61
• 3.5. DYRK蛋白激酶誘導(dǎo)Smad3招募EDVP復(fù)合物阻斷其活性與功能61-69
• 3.5.1 VPRBP和DDB1與Smad3具有相互作用62-63
• 3.5.2 敲低EDVP復(fù)合體成分上調(diào)TGF-β信號(hào)通過(guò)增強(qiáng)Smad3的穩(wěn)定性63-65
• 3.5.3 過(guò)表達(dá)EDVP復(fù)合體成員蛋白抑制TGF-β信號(hào)通路通過(guò)促進(jìn)Smad3的降解65-67
• 3.5.4 EDVP復(fù)合物可能泛素化修飾Smad3的Lys333殘基67-69
• 4 結(jié)論與討論69-73
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 作者簡(jiǎn)介和科研成果79

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