發(fā)布時間：2017-09-18 04:08

  本文關鍵詞：DYRK蛋白激酶調控TGF-β信號通路的功能與機制研究

  更多相關文章： 信號轉導 TGF-β DYRKs E3泛素化復合物 磷酸化

【摘要】：轉化生長因子-β (TGF-β)是一類多功能的細胞因子,能調控多種類型細胞的增殖、分化與凋亡,調節(jié)免疫系統(tǒng)和胚胎發(fā)育等過程,在多種疾病中發(fā)揮重要作用。以腫瘤為例,在其發(fā)展初期,TGF-β通過促進細胞的分化、凋亡等過程抑制腫瘤進展；后期腫瘤中,TGF-β則通過促進腫瘤細胞的上皮間充質轉分化、誘導腫瘤血管生成和協(xié)助腫瘤細胞免疫逃逸等過程,導致腫瘤的惡化。TGF-β在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用相當關鍵,但對TGF-β信號是如何受到環(huán)境和遺傳等因素的調控,目前仍舊所知甚少,值得進一步探索。通過對人全激酶的功能蛋白組學篩選,我們發(fā)現(xiàn)雙特異性酪氨酸磷酸化調控激酶(DYRKs),依賴其絲蘇氨酸激酶活性,通過介導Smad3的泛素化修飾,反向調控TGF-β/Smad信號通路。生化分析表明,DYRK蛋白激酶直接磷酸化Smad3 Linker區(qū)域的Thr179殘基,導致Smad3通過與底物識別蛋白VPRBP結合,并在DDB1的作用下,招募EDD E3連接酶。VPRBP-DDB1-EDD (EDVP)復合物進而泛素化修飾Smad3,阻斷Smad3與啟動子及轉錄共激活子的結合,從而抑制TGF-p信號通路的活化。另外,敲減VPRBP、DDB1或用小分子抑制劑INDY抑制DYRK蛋白激酶的活性,將會促進TGF-β/Smad信號通路的活化。這些結果表明,DYRK蛋白激酶誘導的Smad3的磷酸化及后續(xù)EDVP E3復合物的招募對TGF-β/Smad信號有較為顯著的影響。因此,我們的研究鑒定了TGF-β/Smad信號與功能的新的調控因子,也闡述了其調控的分子機制,這對于理解TGF-β這一關鍵細胞通路有較為重要的意義。
【關鍵詞】：信號轉導 TGF-β DYRKs E3泛素化復合物 磷酸化
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R363
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12
• 1 文獻綜述12-25
• 1.1 TGF-β信號通路及信號調控12-18
• 1.1.1 TGF-β超家族12-13
• 1.1.2 TGF-β信號通路13-15
• 1.1.3 TGF-β信號通路的功能15-16
• 1.1.4 TGF-β信號通路的調控16-18
• 1.2 蛋白激酶18-19
• 1.3 DYRK蛋白激酶19-22
• 1.3.1 DYRK蛋白激酶的結構19-21
• 1.3.2 DYRK蛋白激酶的功能21-22
• 1.4 泛素化修飾及功能調控22-23
• 1.5 EDVP復合物23-25
• 2 材料與方法25-44
• 2.1 材料25-29
• 2.1.1 細胞系與菌株25
• 2.1.2 主要的抗體25-26
• 2.1.3 主要試劑26-27
• 2.1.4 常規(guī)溶液配制27-29
• 2.2 實驗儀器29-31
• 2.3 實驗方法31-44
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)31-32
• 2.3.2 細胞轉染32-33
• 2.3.3 Western blot技術33-34
• 2.3.4 熒光素酶報告基因檢測34
• 2.3.5 免疫共沉淀技術(Co-IP)34-35
• 2.3.6 體外激酶反應35-36
• 2.3.7 γ-S體外激酶反應36-37
• 2.3.8 siRNA技術37-38
• 2.3.9 DNA Pull-Down38-39
• 2.3.10 質粒構建39-41
• 2.3.11 大腸桿菌轉化41
• 2.3.12 定點突變技術41-42
• 2.3.13 Real-Time PCR技術42-44
• 3 結果與分析44-69
• 3.1 DYRK蛋白激酶負調控TGF-β信號通路44-49
• 3.1.1 DYRK蛋白激酶比較顯著地抑制TGF-β信號通路44-45
• 3.1.2 DYRK蛋白激酶抑制TGF-β信號通路依賴于它們的激酶活性45-47
• 3.1.3 敲低DYRK蛋白激酶將增強TGF-β信號通路47-49
• 3.2 DYRK蛋白激酶與Smad3相互作用形成復合體49-51
• 3.3 DYRK蛋白激酶直接磷酸化修飾Smad351-57
• 3.3.1 DYRK蛋白激酶在細胞內或體外磷酸化修飾Smad3的多個位點51-53
• 3.3.2 DYRK蛋白激酶磷酸化修飾Smad3的Thr132和Thr179殘基53-55
• 3.3.3 DYRK蛋白激酶在細胞內和體外均促進Smad3的C端SXS位點的磷酸化55-57
• 3.4. DYRK蛋白激酶介導的修飾阻斷Smad3與啟動子結合57-61
• 3.4.1 DYRK蛋白激酶促進Smad3：Smad4復合物的形成57-59
• 3.4.2 核質分離實驗表明DYRK2促進Smad3的入核59-60
• 3.4.3 DYRK2減弱Smad3與轉錄共激活子p300的結合60-61
• 3.4.4 DYRK2減弱Smad3結合DNA的能力61
• 3.5. DYRK蛋白激酶誘導Smad3招募EDVP復合物阻斷其活性與功能61-69
• 3.5.1 VPRBP和DDB1與Smad3具有相互作用62-63
• 3.5.2 敲低EDVP復合體成分上調TGF-β信號通過增強Smad3的穩(wěn)定性63-65
• 3.5.3 過表達EDVP復合體成員蛋白抑制TGF-β信號通路通過促進Smad3的降解65-67
• 3.5.4 EDVP復合物可能泛素化修飾Smad3的Lys333殘基67-69
• 4 結論與討論69-73
• 參考文獻73-79
• 作者簡介和科研成果79

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