發(fā)布時間：2017-09-17 10:02

  本文關(guān)鍵詞：呼吸道合胞病毒感染導(dǎo)致大鼠腎病病理模型持續(xù)感染證據(jù)研究

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【摘要】：目的探討呼吸道合胞病毒(RSV)感染SD大鼠的腎病病理模型中,RSV持續(xù)感染證據(jù)。方法選取2個月齡、體重為180~200g的清潔級雄性SD大鼠62只為研究對象。采用隨機數(shù)字表法將其隨機分為RSV組(n=35)與對照組(n=27)。1對RSV組SD大鼠,采用毒力皰斑形成單位(PFU)為6×106 RSV液(0.4mL/d腹腔注射+0.2mL/d鼻腔滴注)×3d處理,建立RSV感染SD大鼠腎病病理模型。對照組采用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.4mL/d腹腔注射+0.2mL/d鼻腔滴注)×3d處理,建立對照組PBS模型。兩組均以造模前1d計算為第0天,造模結(jié)束時計算為造模成功第1天。通過電子顯微鏡觀察RSV感染SD大鼠腎病病理模型造模結(jié)束后第7與60天的腎小球超微結(jié)構(gòu)改變,判斷SD大鼠腎病病理模型造模是否成功。2RSV組SD大鼠腎病病理模型造模成功后,將35只SD大鼠平均分為7個亞組(RSV 0、7、15、30、60、90及120d亞組),每個亞組均為5只SD大鼠;將對照組27只PBS模型SD大鼠,按照上述時間點分為7個亞組(PBS 0、7、15、30、60、90及120d亞組),每個亞組分別為5、5、5、3、3、3、3只SD大鼠。分別測定各個RSV亞組與PBS亞組SD大鼠的24h尿蛋白定量、血清白蛋白及血清肌酐水平等指標(biāo),并進行統(tǒng)計學(xué)分析。3于上述指標(biāo)測定完畢后,分別于上述時間點處死RSV亞組與PBS亞組SD大鼠。同時,切除SD大鼠左腎下2/3、左肺下2/3和脾下2/3,以4%多聚甲醛固定24h后,石蠟包埋后切片,采用蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察各個亞組SD大鼠腎、肺、脾組織是否發(fā)生病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。4以RSV G蛋白單克隆抗體為一抗,制作RSV組SD大鼠腎、肺、脾組織免疫組化檢測標(biāo)本,于光鏡下尋找各個RSV亞組RSV G蛋白存在證據(jù)。5以RSV G蛋白單克隆抗體為一抗,采用與綠色熒光試劑結(jié)合,同時采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料藍染細胞核,制作各個RSV亞組SD大鼠腎組織熒光免疫檢測標(biāo)本,于熒光顯微鏡下尋找RSV G蛋白存在證據(jù)及其與細胞核關(guān)系。6切除剩余RSV亞組左腎上1/3,以3%戊二醛固定后,送至四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科制作電子顯微鏡標(biāo)本,于電子顯微鏡下觀察各個RSV亞組SD大鼠腎小球超微結(jié)構(gòu)是否發(fā)生病理改變,同時尋找RSV顆粒。結(jié)果 1RSV組SD大鼠腎病病理模型造模成功,對照組PBS模型亦造模成功。2各個RSV亞組與PBS亞組SD大鼠的24h尿蛋白定量水平檢測結(jié)果顯示,RSV 0與90d亞組分別與相同時間點PBS亞組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而RSV 7、15、30、60及120d亞組,卻分別較相同時間點PBS亞組均顯著升高,并且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.9、3.1、3.9、2.2、5.6,P0.05)。血清白蛋白及血清肌酐水平檢測結(jié)果顯示,7個RSV亞組分別與相同時間點的7個PBS亞組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3于光鏡下觀察各個RSV亞組SD大鼠的腎、肺、脾組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE染色)結(jié)果顯示,除RSV 0d亞組外,其余各個亞組腎、肺、脾組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度病理改變。4于光鏡下觀察各個RSV亞組SD大鼠的腎、肺、脾組織免疫組化技術(shù)檢測結(jié)果顯示,除RSV 0d亞組外,其余各個RSV亞組腎、肺、脾組織中,均有特異性RSV G蛋白呈持續(xù)陽性表達。各個RSV亞組腎小球RSV G蛋白定量分析結(jié)果顯示,RSV 0、7、15及30d亞組RSV G蛋白表達水平呈逐漸增強趨勢,并維持在高水平,但在RSV 60、90及120d亞組又呈逐漸減弱趨勢。5于熒光顯微鏡下觀察各個RSV亞組SD大鼠腎組織RSV G蛋白熒光免疫檢測結(jié)果顯示,RSV G蛋白與DAPI藍染的細胞核重疊。6透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),RSV組腎組織中RSV顆粒持續(xù)存在,RSV 120d亞組腎小球超微結(jié)構(gòu)仍存在病理改變。結(jié)論RSVG蛋白在RSV感染SD大鼠腎病病理模型造模成功后,大鼠腎、肺、脾組織中RSV G蛋白呈持續(xù)陽性表達,證明RSV呈持續(xù)感染狀態(tài)。這一結(jié)果或提示,包括RSV在內(nèi)的呼吸道病毒持續(xù)感染,是導(dǎo)致微小病變型腎病綜合征(MCNS)患兒免疫功能紊亂的主要原因。
【作者單位】： 四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科;
【關(guān)鍵詞】： 微小病變型腎病綜合征 呼吸道合胞病毒感染 持續(xù)感染 熒光免疫測定 病理學(xué)模型 腎病 兒童
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(81370807)~~
【分類號】：R725.1;R726.9;R-332
【正文快照】： 微小病變型腎病綜合征(minimal　change實驗過程對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求。nephritic　syndrome,MCNS)因其在兒童中的高發(fā)1.2　方法病率和治療手段有限,成為臨床棘手疾病之一[1]。1.2.1　制作RSV組SD大鼠腎病病理模型與對照對于MCNS發(fā)病機制的研究,目前主要集中于對體

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本文編號：868735