發(fā)布時(shí)間：2017-09-17 00:03

  本文關(guān)鍵詞：小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其沉默效應(yīng)研究

  更多相關(guān)文章： B- RNAi 慢病毒 共刺激信號(hào) L

【摘要】：目的:構(gòu)建介導(dǎo)小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒載體,研究其對(duì)L929細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá)的沉默效應(yīng)。方法:從小鼠B7-1基因編碼區(qū)選擇3段RNA干擾靶序列,制備轉(zhuǎn)錄雙發(fā)夾RNA的前體DNA,并克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒,構(gòu)建B7-1的RNAi慢病毒穿梭載體,測(cè)序鑒定。將重組質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒,經(jīng)超速離心獲得濃縮慢病毒顆粒。通過(guò)測(cè)定293T細(xì)胞GFP表達(dá)水平確定病毒滴度,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染效率以及對(duì)細(xì)胞表面B7-1的干擾效率。病毒感染細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選及克隆培養(yǎng)獲得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞中GFP及B7-1分子表達(dá)的狀況;將感染細(xì)胞與分離的小鼠脾臟T細(xì)胞混合培養(yǎng),分析B7-1穩(wěn)定沉默細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果:成功了構(gòu)建小鼠B7-1基因RNA干擾的重組慢病毒載體;獲得了滴度達(dá)(3~5)×10~8TU/ml的濃縮重組慢病毒,重組慢病毒可有效感染L929細(xì)胞介導(dǎo)GFP表達(dá)以及沉默其表面的B7-1。經(jīng)篩選獲得慢病毒穩(wěn)定感染的L929細(xì)胞,該細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá)受到抑制,刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著下降(P0.05)。結(jié)論:構(gòu)建了能夠高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒載體,該載體可穩(wěn)定沉默L929細(xì)胞表面B7-1分子表達(dá),抑制B7-1/CD28信號(hào)誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖效應(yīng)。
【作者單位】： 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系;蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院;蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科;
【關(guān)鍵詞】： B- RNAi 慢病毒 共刺激信號(hào) L
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373236)資助
【分類號(hào)】：R392
【正文快照】： 1本文受國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373236)資助。2蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,蘇州215123。3蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科,蘇州215000。B7-1是重要的T細(xì)胞共刺激分子,與表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28/CTLA4結(jié)合所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)對(duì)T細(xì)胞活化反應(yīng)的維持和免疫應(yīng)答的擴(kuò)大具有關(guān)鍵作用[1],

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【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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9 張U，

本文編號(hào)：866052