本文關(guān)鍵詞：小鼠B7-1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其沉默效應研究

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【摘要】：目的:構(gòu)建介導小鼠B7-1基因RNAi的慢病毒載體,研究其對L929細胞表面B7-1分子表達的沉默效應。方法:從小鼠B7-1基因編碼區(qū)選擇3段RNA干擾靶序列,制備轉(zhuǎn)錄雙發(fā)夾RNA的前體DNA,并克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒,構(gòu)建B7-1的RNAi慢病毒穿梭載體,測序鑒定。將重組質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生慢病毒,經(jīng)超速離心獲得濃縮慢病毒顆粒。通過測定293T細胞GFP表達水平確定病毒滴度,流式細胞術(shù)檢測感染效率以及對細胞表面B7-1的干擾效率。病毒感染細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選及克隆培養(yǎng)獲得小鼠B7-1基因RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞,流式細胞術(shù)分析細胞中GFP及B7-1分子表達的狀況;將感染細胞與分離的小鼠脾臟T細胞混合培養(yǎng),分析B7-1穩(wěn)定沉默細胞刺激T細胞增殖的能力。結(jié)果:成功了構(gòu)建小鼠B7-1基因RNA干擾的重組慢病毒載體;獲得了滴度達(3~5)×10~8TU/ml的濃縮重組慢病毒,重組慢病毒可有效感染L929細胞介導GFP表達以及沉默其表面的B7-1。經(jīng)篩選獲得慢病毒穩(wěn)定感染的L929細胞,該細胞表面B7-1分子表達受到抑制,刺激T細胞增殖的能力顯著下降(P0.05)。結(jié)論:構(gòu)建了能夠高效感染及沉默小鼠B7-1分子的RNAi慢病毒載體,該載體可穩(wěn)定沉默L929細胞表面B7-1分子表達,抑制B7-1/CD28信號誘導的T細胞增殖效應。
【作者單位】： 蘇州大學醫(yī)學部免疫學系;蘇州大學生物醫(yī)學研究院;蘇州大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科;
【關(guān)鍵詞】： B- RNAi 慢病毒 共刺激信號 L
【基金】：國家自然科學基金面上項目(81373236)資助
【分類號】：R392
【正文快照】： 1本文受國家自然科學基金面上項目(81373236)資助。2蘇州大學生物醫(yī)學研究院,蘇州215123。3蘇州大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科,蘇州215000。B7-1是重要的T細胞共刺激分子,與表達于T細胞表面的CD28/CTLA4結(jié)合所轉(zhuǎn)導的細胞信號對T細胞活化反應的維持和免疫應答的擴大具有關(guān)鍵作用[1],

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