本文關(guān)鍵詞：Nfic基因3′UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建及其與miR-20a靶向關(guān)系的驗(yàn)證

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【摘要】：目的構(gòu)建核因子C(nuclear factor I-C,Nfic)基因3′非編碼區(qū)(3′UTR)熒光素酶報告質(zhì)粒,利用雙熒光素酶報告基因驗(yàn)證micro RNA-20a(miR-20a)與其潛在靶基因Nfic的靶向關(guān)系。方法通過micro RNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan獲取miR-20a與Nfic基因3′UTR潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn);PCR擴(kuò)增出Nfic基因3′UTR序列,將此序列克隆至熒光素酶報告載體p MIR-Report Luciferase;將重組熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-20a mimics(實(shí)驗(yàn)組)或NCmimics(對照組)共同轉(zhuǎn)染293-AD細(xì)胞,收集細(xì)胞后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測2組細(xì)胞的熒光素酶活性,從而對Nfic與miR-20a的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系進(jìn)行鑒定。將miR-20a mimics和NC mimics分別轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2,裂解細(xì)胞提取蛋白后采用Western blotting檢測NFIC蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果構(gòu)建的重組熒光素酶報告質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定正確。雙熒光素酶報告基因檢測顯示,與對照組相比,miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR報告基因載體的熒光素酶活性(P0.05);Western blotting結(jié)果顯示,與對照組相比,ST2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-20a mimics后NFIC蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。結(jié)論成功構(gòu)建了Nfic基因3′UTR熒光素酶報告質(zhì)粒,而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR,抑制其熒光素酶活性。
【作者單位】： 天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： 微RNAs ′非翻譯區(qū) miR-a Nfic 骨髓基質(zhì)細(xì)胞系 熒光素酶報告基因
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271977,81472040)
【分類號】：R3416
【正文快照】： micro RNAs是一類約22個核苷酸組成的種類豐富且進(jìn)化保守的單鏈非編碼小分子RNA,可以通過與靶基因m RNA完全互補(bǔ)配對而降解m RNA,或者與m RNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)部分互補(bǔ)配對而阻斷蛋白質(zhì)翻譯,從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[1-2]。本課題組前期研究

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