本文關(guān)鍵詞：NDiV致病性初步研究及實時熒光PCR檢測方法的建立

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【摘要】：目的Nam Dinh virus(以下簡稱NDiV)是近年新發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒,本課題組在國內(nèi)首次成功從成蚊中分離,但該病毒流行病學意義和檢測方法尚鮮見報道。本次研究擬建立一種特異、快速檢測成蚊中NDiV的實時熒光定量PCR方法,為環(huán)境中的蚊蟲攜帶NDiV的狀況提供快速檢測的方法提供參考。通過動物試驗了解NDiV其致病作用,為指導蟲媒傳染病的控制提供依據(jù)。方法用C6/36細胞培養(yǎng)Nam Dinh病毒,待4-6天出現(xiàn)明顯細胞病變時離心純化病毒,50%細胞終點法測定病毒滴度。將已測定滴度的NDiV分離物分別在蚊蟲細胞(C6/36細胞)和哺乳動物細胞培養(yǎng),觀察NDiV在不同細胞的生長狀況。動物實驗:(a)3-4日齡乳鼠,分組處理后在乳鼠腦部、腹腔和鼻腔接種不同劑量的病毒分離液,觀察乳鼠接種病毒后的發(fā)病情況并作記錄,提取發(fā)病組織研磨液核酸做RT-PCR檢測并做病毒鑒定。(b)6日齡SPF雞胚,分組處理后在SPF雞胚卵黃囊、尿囊腔、羊膜腔接種不同劑量的病毒分離液,觀察其孵育情況。(c)雛雞,分組處理后在雛雞的腦內(nèi)接種、翅膀刺種和口服的途徑接種病毒分離液,記錄出現(xiàn)癥狀的雛雞數(shù)。收集乳鼠和雞胚的發(fā)病部位或組織,研磨后提取核酸做RT-PCR檢測。以上實驗均設(shè)立對照組。分析NCBI中的越南和中國的NDiV病毒株全序列特征,選取保守區(qū)域RdRp基因,設(shè)計NDiV的特異性引物與TaqMan-MGB探針,通過優(yōu)化試驗后驗證所建立方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和應用性。建立特異性高、靈敏度強的實時熒光PCR快速檢測方法。結(jié)果利用建立的RT-PCR方法檢測NDiV分離物在蚊蟲細胞(C6/36細胞)和哺乳動物細胞隨時間的生長情況,檢測結(jié)果顯示病毒只在蚊蟲細胞中有增殖,在哺乳動物細胞中無生長。NDiV對C6/36細胞有明顯的病變效應,C6/36細胞是NDiV的敏感細胞;經(jīng)C6/36細胞50%終點法計算得出NDiV病毒滴度為:1.41×106PFU/ml。乳鼠、雞胚和雛雞的不同部位經(jīng)不同劑量的NDiV染毒后,沒有出現(xiàn)明顯的發(fā)病情況。通過多次的優(yōu)化試驗首次建立了NDiV MGB探針RT-PCR的檢測方法。該檢測方法用時短,靈敏度高,最低檢測下限為1PFU/ml。該方法有良好的特異性,與登革熱1-4血清型病毒、流行性乙型腦炎病毒、輪狀病毒、人呼吸道合胞病毒、腺病毒、星狀病毒無交叉反應;4份核酸含量不同的NDiV標準品重復測5次,Ct值的變異系數(shù)范圍在1.67%~3.68%,有較高的穩(wěn)定性。通過檢測,龍崗區(qū)蚊蟲NDiV攜帶率為18%,以居民區(qū)、醫(yī)院和場館的蚊蟲攜帶NDiV比例最高,分別為22%、25%、31%。其它區(qū)域蚊蟲攜帶NDiV比例較低。結(jié)論C6/36細胞是NDiV感染的敏感細胞,NDiV在C6/36細胞能產(chǎn)生病變效應,但病毒在哺乳類動物細胞未見增殖。通過實驗觀察發(fā)現(xiàn),NDiV對乳鼠及雞胚沒有明顯的致病作用。NDiV的TaqMan-MGB探針RT-PCR方法是一種特異、快速、靈敏高及穩(wěn)定性好的方法,可應用于NDiV的流行病學監(jiān)測工作,提高該病毒的快速檢測的能力。
【關(guān)鍵詞】：TaqMan-MGB Nam Dinh病毒 致病性 50%終點法
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-16
• 1．NDi V介紹10-14
• 1.1 NDi V的概述10-11
• 1.2 NDi V分子生物學特征11-13
• 1.3 NDi V與Cav V、DKNV關(guān)聯(lián)性分析13-14
• 2．研究的意義和目的14-16
• 第一章 NDi V對動物致病性的研究16-27
• 1. 材料16-17
• 2. 方法17-20
• 2.1 標本處理17-18
• 2.2 NDi V株的獲取途徑和細胞傳代18-19
• 2.2.1 細胞復蘇18
• 2.2.2 細胞傳代和培養(yǎng)18
• 2.2.3 NDi V在C6/36 細胞染毒和觀察18
• 2.2.4 NDi V病毒滴度的測定（標準品的制備）18-19
• 2.2.5 NDi V在蚊蟲及哺乳動物細胞中的培養(yǎng)19
• 2.3 NDi V對小鼠的致病性觀察19-20
• 2.3.1 NDi V病毒對乳鼠的致病性19
• 2.3.2 NDi V對乳鼠腦部及各臟器大體形態(tài)學影響分析19-20
• 2.4 NDi V對雞致病性20
• 2.4.1 NDi V對SPF雞胚致病性20
• 2.4.2 NDi V對雛雞的毒力試驗20
• 3. 結(jié)果20-25
• 3.1 病毒分離結(jié)果20-21
• 3.2 NDi V病毒滴度測定結(jié)果21-22
• 3.2.1 NDi V在不同細胞的生長結(jié)果22
• 3.3 NDi V對動物的毒力結(jié)果22-25
• 3.3.1 細胞傳代的病毒株對小鼠的致病性結(jié)果22-23
• 3.3.2 NDi V對乳鼠腦部及各臟器大體形態(tài)學影響結(jié)果23
• 3.3.3 NDi V對雞胚的致病性結(jié)果23-24
• 3.3.4 NDi V對雛雞的毒力結(jié)果24-25
• 4. 討論25-26
• 5. 結(jié)論26-27
• 第二章 實時熒光PCR檢測Nam Dinh病毒方法的建立及初步應用27-43
• 1. 材料27-29
• 2. 方法29-34
• 2.1 Rd Rp基因特異性片段篩選29-30
• 2.2 病毒核酸的提取30-31
• 2.3 實時熒光RT- PCR引物反應性實驗31-32
• 2.4 測序驗證32
• 2.5 Taq Man- MGB探針實時熒光PCR反應體系的建立和優(yōu)化32-33
• 2.5.1 退火溫度的優(yōu)化33
• 2.5.2 酶用量的優(yōu)化33
• 2.5.3 探針濃度的優(yōu)化33
• 2.5.4 上下游引物濃度的優(yōu)化33
• 2.5.5 Mg~(2+)濃度的優(yōu)化33
• 2.6 Taq Man-MGB探針實時熒光PCR反應體系的評估33-34
• 2.6.1 特異性試驗33-34
• 2.6.2 靈敏度實驗34
• 2.6.3 穩(wěn)定性實驗34
• 2.7 龍崗區(qū)蚊媒攜帶NDi V的檢測34
• 3. 結(jié)果34-41
• 3.1 PCR反應性結(jié)果34-35
• 3.2 RT-PCR產(chǎn)物測序驗證結(jié)果35
• 3.3 Taq Man- MGB探針實時熒光PCR反應體系優(yōu)化結(jié)果35-38
• 3.3.1 退火溫度優(yōu)化結(jié)果35-36
• 3.3.2 Taq DNA聚合酶用量優(yōu)化結(jié)果36
• 3.3.3 Taq Man-MGB探針濃度的優(yōu)化結(jié)果36-37
• 3.3.4 引物濃度的優(yōu)化結(jié)果37-38
• 3.3.5 Mg~(2+)濃度的優(yōu)化結(jié)果38
• 3.4 PCR應用性結(jié)果38-40
• 3.4.1 特異性實驗結(jié)果38-39
• 3.4.2 靈敏度實驗結(jié)果39-40
• 3.4.3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果40
• 3.5 龍崗區(qū)蚊媒NDi V攜帶率結(jié)果40-41
• 4. 討論41-42
• 5. 結(jié)論42-43
• 本文研究創(chuàng)新之處43
• 不足之處43-44
• 參考文獻44-47
• 綜述47-56
• 參考文獻53-56
• 附錄 156-57
• 附錄 257-58
• 碩士期間發(fā)表的論文58-59
• 致謝59-60

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本文編號：665555